オーストリアにおける家畜および野生の反芻動物からのシラミバエ(双翅目:カバエ科)の分子病原体スクリーニング
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オーストリアにおける家畜および野生の反芻動物からのシラミバエ(双翅目:カバエ科)の分子病原体スクリーニング

May 19, 2023

寄生虫とベクター 16 巻、記事番号: 179 (2023) この記事を引用

259 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

カバエ(双翅目:カバエ科)は、シラミバエまたはケドとしても知られ、動物の偏性吸血外部寄生虫であり、偶発的に人間にも吸血します。 ヒトおよび獣医学の病原体の媒介者としてのカバ科の潜在的な役割はますます研究されていますが、ヨーロッパの一部ではシラミバエにおける感染因子の存在と分布はまだ不明です。 今回我々は、オーストリアの家畜や野生動物に寄生するカバエ科のベクター媒介病原体を分子遺伝学を利用して検出し、特徴づけるために報告する。

シラミバエは、2015 年から 2019 年にかけてオーストリア全土で自然に感染した牛 (n = 25)、羊 (n = 3)、アカシカ (n = 12) から収集されました。個々の昆虫は種レベルまで形態学的に同定され、DNA 抽出が行われました。分子病原体のスクリーニングとバーコーディング。 各シラミバエからのゲノム DNA を、ボレリア属、バルトネラ属、トリパノソマチダ属、アナプラズマ科、フィラリオデア属およびピロプラスミダ属についてスクリーニングしました。 Trypanosomatida および Bartonella spp. の配列を取得しました。 系統発生およびハプロタイプネットワーク分析によってさらに特徴付けられました。

3 種に相当する合計 282 匹のカバ科のハエが同定されました。ウシから採取した Hippobosca equina (n = 62)、ヒツジから採取した Melophagus ovinus (n = 100)、アカシカ (Cervus elaphus) から採取した Lipoptena cervi (n = 120) です。 分子スクリーニングにより、同一個体における単一(63.39%)、2つ(30.71%)、最大3つ(5.90%)の異なる病原体による感染を含む、54.3%のカバ科動物で病原体DNAが明らかになりました。 バルトネラ DNA はシラミバエの 36.9% で検出されました。 Lipoptena cervi は、これまで報告されていなかった 10 種類の Bartonella sp. に感染しました。 ハプロタイプ、いくつかは人獣共通感染症の可能性のある株と密接に関連しています。 トリパノソーマ属の DNA は、トリパノソーマ属の最初の記載を含む海馬類の 34% で同定されました。 H. equina で。 アナプラズマ科の DNA (ボルバキア属) は M. オビナス (16%) でのみ検出されましたが、シラミバエの < 1% がボレリア属の陽性でした。 そしてフィラリオデア。 すべてのカバ科動物はピロプラスミダに対して陰性でした。

分子遺伝学的スクリーニングにより、オーストリアの家畜および野生の反芻動物に寄生するカバ科動物に、人獣共通感染症の可能性のある新規病原体ハプロタイプ(例:バルトネラ属)やトリパノソーマ属の最初の報告を含むいくつかの病原体の存在が確認された。 このことは、このシラミバエが動物のトリパノソマチッドの媒介者として役割を果たしている可能性を示唆しています。 One-Health の文脈において、これらの外部寄生生物が感染病原体を媒介する能力を明らかにするには、実験的感染研究とカバ科ハエおよびカバ関連病原体のモニタリングの拡大が必要である。

シラミバエまたはケドとしても知られるカバ目ハエ (双翅目: Hippoboscidae) は、世界中の哺乳類や鳥類に寄生する必須の吸血外部寄生虫です [1]。 現在まで、カバ類に関するほとんどの研究は、その生物学、進化、宿主特異性、および動物や人間に対する吸血行動や噛みつき行動の影響を理解することに焦点を当ててきました[2,3,4,5,6,7,8]。 Melophagus spp.、Lipoptena spp.属のさまざまなシラミバエ種およびヒポボスカ属。 ヨーロッパでは一般的に家畜および野生の有蹄動物に寄生しており[9,10,11]、時には人間やペットも襲うことが報告されている[12,13,14,15]。 実際、エッツタール・アルプスの後期新石器時代の人間のミイラ「エッツィ」で一般的なシカのリポテナ・セルヴィが確認されたことから示唆されているように、カバ科のハエは数千年にわたって人間を攻撃してきた可能性があるようである[16]。 吸血の性質、広範な分布、および一部の種の広範な宿主スペクトルを考慮すると、カバエ科のハエは、動物集団内および動物と人間の間の感染症の潜在的な媒介者としても機能する可能性があります[17]。

カババエは動物病原体の媒介者としての役割について 1 世紀以上にわたって研究されており [18、19]、過去 20 年間の分子研究により、さまざまなシラミバエ種において医学的および獣医学的に重要ないくつかのカババエ関連病原体が確認されている [17]。 。 ヨーロッパの一部の国では、アナプラズマ属、バベシア属、バルトネラ属、ボレリア属、マイコプラズマ属、リケッチア属を含む広範囲のベクター媒介細菌および原生動物が、家畜および野生の反芻動物から収集されたカバエ科のハエで確認されている。 、タイレリア属(Theileria spp.)。 およびトリパノソーマ属。 [20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31]。 こうした研究努力にも関わらず、オーストリアを含むヨーロッパでは、カバエ科の媒介媒介疾患の存在と監視に関して、依然として大きな知識不足が存在する。 さらに、オーストリアでは感染病原体の保有源となる可能性のある野生の反芻動物が放し飼いに広く分布していること[32、33]、および仕事やレジャー活動により野生動物が生息する地域への人間の存在が増加していることを考慮すると、媒介動物の役割は、カバ科の動物についてはさらなる解明が必要である。

本研究の目的は、オーストリアの家畜および野生の反芻動物に寄生するカバエ科のハエからベクター媒介病原体の存在を分子技術を用いて検出することであった。 さらに、カバエ科のハエの DNA バーコーディングを実行して、その正体を確認し、特徴付けました。

カバ科のハエは、2015 年から 2019 年にかけてオーストリアのさまざまな場所でアカシカ (Cervus elaphus; n = 12)、ヒツジ (Ovis aries; n = 3)、ウシ (Bos taurus; n = 25) から収集されました (図 1)。 。 アカシカに寄生するカバ科の動物は、2016 年と 2017 年の 11 月から 12 月にかけて、チロル連邦州のシュヴァーツ (図 1A) とクーフシュタイン (図 1B)、および連邦政府のブルーデンツ (図 1C) の 3 つの場所で狩猟動物からサンプリングされました。フォアアールベルク州。 これらの地域で狩猟されたアカシカは、オーストリア保健・食品安全庁(AGES)による野生動物の結核監視の一環として定期的に検査されています。 カバ科動物は、AGES 研究所に提出された最近狩猟された 12 頭のアカシカの頭皮から採取され、監視プログラムで調査されたすべての狩猟されたアカシカの 20 ~ 30% にシカの皮が存在すると推定されています (W. Glawischnig、私信)。 合計 120 匹のシラミ バエを検査した動物からサンプリングしました。 羊から採取したシラミバエは、2018 年 3 月にニーダーオーストリア連邦州レオバースドルフの農場で直接入手されました (図 1D)。 サンプリング時、農場には成羊 30 頭の群れがあり、100% の羊にケドの存在が観察されました。 毛刈り中に成羊 3 頭から直接、合計 100 個の羊の小屋を収集しました。 ウシのカバ科動物は、2016 年と 2017 年の 7 月と 8 月にザルツブルク連邦州ザールフェルデン地域で放牧動物から収集されました (図 1E)。放牧期 [34]。 場合によっては、31 ~ 57 頭の牛を目視検査したところ、最大 33% の牛でシラミバエが観察されました (蔓延のピークは 8 月)。 牛の毛皮上の昆虫を視覚的に確認した後、2016年から2017年にかけてザールフェルデンの24頭の牛から合計61匹のカバ科の個体が採取されました(一部のシラミバエは同じ動物から採取されました)。 2019年7月にアイゼンシュタットで牛から追加のシラミバエが収集されました(ブルゲンラント連邦州、図1F)。 すべてのサンプリング場所で、カバ科動物を手動または細い鉗子を使用して毛髪/羊毛から分離し、乾燥またはエタノール中で直ちに個別のエッペンドルフチューブに保管しました。 すべてのカバ科動物は、実体顕微鏡 (Nikon SMZ1270、東京、日本) と形態学的キー [35、36] を使用して種レベルまで同定され、続いて DNA 抽出が行われました。

カバ科のハエの起源はオーストリアです。 オーストリアのシュヴァーツ (A)、クーフシュタイン (B)、ブルーデンツ (C)、レオバースドルフ (D)、ザールフェルデン (E) およびアイゼンシュタット (F) にある、家畜および野生の反芻動物からのカバエの収集場所。 詳細については本文を参照してください

分子病原体のスクリーニングと昆虫のバーコーディングのために、個々の海馬科の全 DNA 抽出が行われました。 個々の海馬類を 1.5 ml エッペンドルフ チューブ内で 180 μl の緩衝液 ATL (DNeasy Blood & Tissue Kits、Qiagen) と混合し、チューブごとに 2 つの 1.4 mm セラミック ビーズ (Qiagen、ヒルデン、ドイツ) を加え、続いて機械的に均質化しました。 TissueLyser II (Qiagen、ヒルデン、ドイツ) 室温で 6 分間。 次に、20μlのプロテ​​イナーゼKを加え、チューブをボルテックスし、56℃で一晩インキュベートしました。 インキュベーション後、QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN、Hilden、Germany) を製造業者の指示に従って使用して、昆虫材料から全 DNA を抽出しました。

種の同一性を確認し、収集されたカバ科の遺伝的多様性を調査するために、選択された標本を DNA バーコーディング分析に供しました。 21 頭のカバ科動物から抽出された全 DNA を使用して、表 1 に記載されている従来の PCR [37] によって昆虫のミトコンドリア COI 内の領域を増幅しました。PCR 産物は LGC Genomics GmbH (ベルリン、ドイツ) で配列決定されました。 得られた COI 配列は、BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) および BOLD を使用した生物同定用の GenBank ヌクレオチド データベース上の利用可能な配列と比較することにより、カバ科種の分類学的特徴付けに使用されました。 (www.boldsystems.org、2022 年 6 月 1 日にアクセス)。

各カバ科ハエから得られた DNA は、表 1 にまとめたプライマーと PCR プロトコールを使用して選択した遺伝子を標的とすることにより、ベクター媒介病原体の存在についてスクリーニングされました。カバ科ハエは、アナプラズマ科の細菌 (16S リボソーム RNA) について従来の PCR によってスクリーニングされました。 、ボレリア属 (16S リボソーム RNA)、バルトネラ属 (クエン酸シンターゼ遺伝子 - gltA)、およびフィラリオデア上科の線虫 (ミトコンドリアのシトクロム c オキシダーゼ サブユニット I 遺伝子 - COI) が含まれます。 さらに、ネステッド PCR を使用して、トリパノソマチダ目 (18S リボソーム RNA) およびピロプラスミダ目 (18S リボソーム RNA) の寄生虫について DNA をスクリーニングしました。 PCR 方法論は、本研究のために設計されたトリパノソマチダ用のネステッド PCR プロトコールを除き、以前に公開されたプロトコール [38、39、40、41、42] に基づいていました。 後者のプライマーは、GenBank で入手可能な Trypanosomatida のすべての 18S 配列に基づいて設計されており、すべての株の増幅が可能です。 すべての PCR 反応は Eppendorf Mastercycler Pro (Eppendorf AG、ハンブルク、ドイツ) で実行されました。 PCR 産物は、Midri Green Advanced 色素 (Biozym Scientific、ドイツ) で染色した 2% アガロースゲルでの電気泳動による増幅された目的領域の確認まで 15 °C で保存しました。 調査した病原体に対して陽性の PCR 産物は、LGC Genomics GmbH (ベルリン、ドイツ) で増幅プライマーを使用して配列決定されました。 配列は BioEdit [43] で組み立てられ、複数の BLAST 検索を使用して NCBI GenBank (国立バイオテクノロジー情報センター; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) で入手可能な配列と比較されました。

Trypanosomatida および Bartonella spp. の選択された配列。 調査された海馬類から単離された動物は、以前に記載されている [44] ように、修正を加えて系統解析に供されました。 配列を整列させてプライマー結合領域に合わせて切断し、エレクトロフェログラムで二重ピークがないか手動でチェックしました。 19/27 Bartonella spp. で二重ピークが確認されました。 この配列は、バルトネラ属の 2 つの異なる株による同時感染を示唆しました。 同じ昆虫でも。 このような場合、2 つの株をアンフェーズして単一の配列を取得し、個別の配列として GenBank にアップロードしました。 各株を個別に GenBank (トリパノソマチダの場合は登録番号 ON637624 ~ ON637640、バルトネラ属の場合は OP198738 ~ OP198806) にアップロードし、系統解析に使用しました。

検出された(および関連する)トリパノソマチダ属およびバルトネラ属の遺伝的多様性の概要を提供すること。 トリパノソーマ属の 409 配列 (991 ヌクレオチド位置) を含むアライメントに基づいて、2 つのグループのそれぞれについて、菌株、最尤法 (ML) およびベイジアン推論 (BI) ツリーが計算されました。 Bartonella spp. の 582 配列 (338 ヌクレオチド位置) アラインメントのギャップは TrimAl v.1.3 [45] を使用して除去され、配列は DAMBE v.7.0.5.1 [46] を使用してハプロタイプに分解され、トリパノソーマ属の 167 個のハプロタイプ (701 ヌクレオチド位置) が残されました。 Bartonella spp. の 261 のハプロタイプ。 トリパノソーマ属のアウトグループとして。 ツリーでは、Belchomonas wendygibsoni (KF054126) の配列が使用されました。 Bartonella spp. のアウトグループとして利用できる適切な配列がなかったため、この木は代わりに中間点に根を張りました。 ML ブートストラップ コンセンサス ツリー (1000 複製) は、W-IQ-TREE Web サーバー [47] を使用し、トリパノソーマ属のモデル TIM3e + I + G4 を適用して計算されました。 および Bartonella spp. の JC は、修正された赤池情報量基準に従ってモデル テストのデータ セットに最適であると提案されました。 BI ツリーは、MrBayes v.3.2.7 [48] を使用して、トリパノソーマ属の次の複雑なモデル GTR + G + I を適用して計算されました。 バルトネラ属の場合は JC。 分析は 10,000,000 世代 (チェーン数: 4) にわたって実行され、1000 番目のツリーごとにサンプリングされました。 最初の 25% のツリーはバーンインとして破棄され、残りの 7500 のツリーに基づいて 50% の多数決コンセンサス ツリーが計算されました。 DNA ハプロタイプ ネットワーク解析の配列は、系統樹で十分にサポートされているクレードに基づいて選択されました (追加ファイル 1: 図 S1 および S2 を参照)。 中央結合ハプロタイプ ネットワークは、デフォルト設定を適用して、Network 10.2.0.0 (Fluxus Technology Ltd.、サフォーク、英国) を使用して計算されました。 ネットワークは、Network Publisher v.2.1.2.5 (Fluxus Technology Ltd.、サフォーク、英国) でグラフィカルに準備され、国とホストに関する情報が提供され、CorelDRAW 2021 (Corel、オタワ、カナダ) で完成されました。

データ処理と記述統計は Microsoft Excel と GraphPad Prism 7 で実行されました。統計分析は R バージョン 4.0.3 で実装されました [49]。 3 つのカバ科動物種における総感染率 (すべての病原体グループを合わせたもの) と各病原体グループの感染有病率の差は、等しいまたは所定の比率の検定 (prop.test) およびホルム・ボンフェローニ法による比率の一対比較によって評価されました (ペアワイズ.prop.test)。 各カバ科種が同一個体内で 1 つだけまたは 2 つの病原体に同時に感染するリスク (陽性/陰性) は、シラミバエ種を説明変数として使用してロジスティック回帰モデル (glm、ファミリー: 「二項」) で評価され、計算されました。オッズ比 (OR) と 95% 信頼区間 (95% CI)。 P < 0.05 のレベルが有意であるとみなされました。

オーストリアのさまざまな地域で、自然に感染した牛 (n = 25)、羊 (n = 3)、アカシカ (n = 12) から合計 282 匹のシラミバエが収集されました。 カバ科動物は、ウシから採取された Hippobosca equina (n = 62、図 2A)、ヒツジから採取された Melophagus ovinus (n = 100、図 2B)、およびアカシカから採取された L. cervi (n = 120、図 2C) として同定されました。 21 匹の個々のカバ科動物 (H. equina、n = 5; M. ovinus、n = 5、L. cervi、n = 11) の太字のバーコード解析により、各シラミバエ種の COI 配列がそれぞれのバーコード インデックス番号内にクラスター化されていることが明らかになりました。 H. equina (BOLD: AAX0882)、M. ovinus (BOLD: AAX4771)、および L. cervi (BOLD: ABX1452) について、ヨーロッパ、北アフリカ、アジアから以前に報告された配列を使用します。 バーコード化されたカバ科動物から得られた COI 配列は、次のアクセッション番号で GenBank に提出されました:ON129173、ON129175、ON129176、ON129178、ON129181 (H. equina)。 ON129174、ON129177、ON129179、ON129180、ON129182(M.オビヌス); ON341137 – ON341147 (L. cervi)。

分子病原体スクリーニングのためのカバ目ハエ。 オーストリアの家畜および野生の反芻動物から収集された馬馬馬 (A)、馬メロファガス (B)、および出馬リポテナ (C) の代表的な個体

分子スクリーニングにより、収集したカバ科動物の 282 匹中 153 匹 (54.3%) に病原体 DNA が存在し、シラミバエの種間で大きな違いがあることが明らかになりました (表 2)。 羊の M. ovinus は、L. cervi (χ2 = 73.944、df = 1、P < 0.001) および H. equina (χ2 = 82.315、df = 1、P < 0.001) と比較して、病原体に感染する頻度が有意に高かった。一方、L. cervi と H. equina の間では総感染率の差は観察されませんでした (χ2 = 2.7502、df = 1、P = 0.09; 表 2)。 カバ科 3 種の陽性者 153 人全員のうち、97 人は 1 つの病原体のみを保有しており (63.4%)、47 人は 2 つの異なる病原体に感染しており (30.7%)、9 つの M. ovinus 検体では 3 つの異なる病原体が確認されました (5.9%)。 同一個体内で単一または複数の病原体に感染した各種のカバ科の割合を図 3 に示します。3 つのカバ科の種のうち、M. オビヌスは H. equina と比較して少なくとも 1 つの病原体に感染する確率が著しく高かった(OR M. ovinus: 2.8 [1.4-5.9]、P < 0.01)、一方、L. cervi は H. equina と比較して単一の病原体に感染する確率がわずかに高かった (OR L. cervi [95% CI] 1.9 [ 0.95–4.05]、P = 0.07)。 Melophagus ovinus は H. equina と比較して 2 つの病原体を同時に感染する可能性が有意に最も高かった (OR = 47.1 [9.8-849.2]、P < 0.001)。 L. cervi と H. equina の間で 2 つの病原体を保有するリスクに差は観察されませんでした (OR = 1.02 [0.1–22.1、P > 0.5])。

病原体陽性カバエ科のハエにおける単独感染および重複感染。 オーストリアの家畜および野生の反芻動物から収集された馬カバ、メロファグス・オビヌス、およびリポテナ・セルビの同一個体において、1、2、または3つの病原体に対して陽性となったカバエ科のハエの割合

バルトネラ属調査したカバ科の 36.9% (104/282) でトリパノソマチダが検出され、次にすべてのシラミバエの 34.0% (96/282) でトリパノソマチダが検出されました。 M. ovinus の個体はバルトネラ属菌に感染していることがより頻繁に見つかりました。 H. equina (χ2 = 17.619、df = 1、P < 0.001) および L. cervi (χ2 = 10.283、df = 1、P < 0.001) との比較。 また、ヒツジの M. オビヌスは、H. equina (χ2 = 101.33、df = 1、P < 0.001) や L. cervi (χ2 = 146.95、df = 1、P < 0.001) と比較して、トリパノソマチダに感染する頻度が高かった。 M. ovinus 個体のみ 5.7% (282 匹中 16 匹、調査したすべてのカバ科動物の 5.7%) でアナプラズマ科に陽性であり、ボレリア属のシラミバエの陽性率は 1% 未満でした。 (M. ovinus 標本 1 つ) および Filarioidea (L. cervi 標本 1 つ)。 調査されたすべての海馬類はピロプラスミダに対して陰性でした。 本研究でスクリーニングされた病原体の配列は、以下の acc に基づいて GenBank に寄託されました。 番号: ON668330 (ボレリア属)、ON678056 (フィラリオイデア属)、ON637624 ~ ON637640 (トリパノソマチダ属)、および OP198738 ~ OP198806 (バルトネラ属)。

バルトネラ属は、H. equina および L. cervi で検出される最も一般的な感染病原体であり、M. ovinus ではトリパノソマチドに次いで 2 番目に頻繁に同定される病原体です (表 2、図 3)。 L. cervi では、いくつかの Bartonella spp.が分離されました。 gltA (クエン酸シンターゼ遺伝子) 配列は Bartonella sp. と 100% の同一性を示しました。 ハンガリーのコウモリ Miniopterus schreibersii から分離された株 (MK140014; 追加ファイル 2: 表 S1 を参照)。 さらに、さまざまな Bartonella spp. L. cervi の gltA 配列は、ノロジカ (Capreolus capreolus; GenBank acc. no.: AJ278184; AJ278185) および L. cervi (AJ564634; AJ564635; 追加ファイル 2) から単離された B. schoenbuchensis の報告された配列と > 99% の同一性を示しました。ドイツ語に。 分離された Bartonella spp. のハプロタイプ ネットワーク解析 L. cervi の gltA 配列により、Bartonella sp. と同一の 1 株 (OP198738) を含む、これまで報告されていない 10 株の新規株が明らかになりました (図 4 および追加ファイル 1)。 ハンガリーのコウモリ M. schreibersii から単離された配列 (図 4)。 Bartonella spp.の幅広い多様性とは対照的に、 L. cervi 株ではハプロタイプが 1 つだけ同定されましたが、H. equina から単離された配列 (OP198794) ではハプロタイプが 1 つだけ同定され、スペイン、フランスおよびニューカレドニアから報告された Bartonella chomelii の配列 (KM215691、KM215690、JN646657) と 100% 同一でした。 4および追加ファイル1)。 バルトネラ属 M. ovinus で同定された配列 (OP198802) は、ペルー、米国、中国の M. ovinus 由来およびチェコのヨーロッパハリネズミ (Erinaceus europaeus) 由来の Candidatus Bartonella melophagi の配列と 100% の同一性を示しました (MZ089835; MT154632; 図 4;追加ファイル 2)。 BI ツリー (追加ファイル 1) では、B. chomelii、Candidatus B. melophagi、および Bartonella sp. の配列が示されています。 他のバルトネラ属と 1 つのクレードに集まっています。 反芻動物から以前に報告されています (BI 事後確率 [BI pp] = 1.0、ML ブートストラップ値 [ML bs] = 99)。 B. chomelii、Candidatus B. melophagi、および Bartonella spp. のほとんどの配列。 本研究では、B. chomelii、B. schoenbuchensis、B. capreoli、Bartonella spp.の 1 つのサブクレードにクラスターとして検出されました。 シーケンス (BI = 1、ML = 100、追加ファイル 1)。 Bartonella sp.は 1 つだけです。 L. cervi 由来の配列 (OP198746) は、B. bovis および Bartonella spp とともに別の姉妹クレードに置かれました。 (BI = 0.98、ML = 85)。

カバ目ハエで検出されたバルトネラの遺伝的多様性。 選択されたバルトネラ属の gltA 配列 (338 bp) の中央結合ハプロタイプ ネットワーク。 現在および以前の研究から、それらの地理的分布 (A) と報告された宿主 (B) が示されています。 円はハプロタイプを表し、円内の数字は個体数を表します。 番号が表示されていない場合は、1 人の個人のみが表されます。 円の隣のラベルは、ハプロタイプの代表的な GenBank アクセッション番号を指定します。 白い円は中間ノードを表します。 ハプロタイプを相互接続する枝上のバーは置換の数を表します。 アスタリスクは、本研究で検出されたハプロタイプを示します。

トリパノソマチド配列 (18S rRNA) はすべての海馬科種で検出され、M. ovinus では最も一般的な病原体であり、87% が陽性個体でした (表 2、図 3)。 トリパノソーマ属 M. ovinus から単離された配列は、チェコ、クロアチアおよび英国のトリパノソーマ メロファギウムの 18S 配列と 100% 同一でした (OM256700; HQ664912; FN666409)。 DNA ハプロタイプ ネットワーク分析により、T. メロファギウムの 2 つの異なる株が明らかになりました。新株 (ON637626) と 2 番目の株 (ON637624) は、クロアチア、英国、チェコの M. オビヌスから単離された T. メロファギウムの配列と同一です (図 5 および追加)ファイル1)。 トリパノソーマ属のトリパノソーマを特徴とするトリパノソマティス陽性反応を示したのは、3 匹の H. equina 個体 (ザールフェルデンから 2 匹、アイゼンシュタットから 1 匹) のみでした。 (ON637634) は、Trypanosoma theileri、T. trinaperronei、T. melophagium、T. cervi、および Trypanosoma spp.を含む他の反芻動物のトリパノソーマ科動物と一緒にクラスター化しました。 (図 5 および追加ファイル 1)。 H. equina から得られたトリパノソーマの配列は、トリパノソーマの配列と > 98% の類似性を共有しました。 米国のオジロジカから分離された cervi (JX178196)、Trypanosoma sp. ロシアのアブから得られた (MK156792-MK15794) および中央アフリカ共和国のツェツェバエから得られた T. theileri (KR024688)。 一方、L. cervi から単離されたトリパノソマチドの配列は、英国および米国のボド属の非寄生性キネトプラスチドの配列と > 99% の同一性を示しました (AY425015; AY028450)。

カバ目ハエで検出されたトリパノソーマの遺伝的多様性。 選択したトリパノソーマ属の 18S rRNA 配列 (779 bp) の中央結合ハプロタイプ ネットワーク。 現在および以前の研究から、それらの地理的分布 (A) と報告された宿主 (B) が示されています。 円はハプロタイプを表し、円内の数字は個体数を表します。 番号が表示されていない場合は、1 人の個人のみが表されます。 円の隣のラベルは、ハプロタイプの代表的な GenBank アクセッション番号を指定します。 白い円は中間ノードを表します。 ハプロタイプを相互接続する枝上のバーは置換の数を表します。 アスタリスクは、本研究で検出されたハプロタイプを示します。

アナプラズマ科の配列 (16S rRNA) は 16 個体の M. オビヌス個体でのみ検出され、以前に M. オビヌスから単離された株 (MF461472; KY224164; KY224163) を含むいくつかのボルバキア株の配列と同一の配列を特徴としていました。 ボレリア属 (16S rRNA) は単一の M. ovinus で検出され、報告されている Borrelia sp. と 93.7% の類似性がありました。 (CP043682) スズメ目の鳥に関連するマダニから分離されました。 最後に、1 匹の L. cervi 個体は、日本のニホンジカ (Cervus nippon) から分離された Mansonella perforata に最も類似 (95.1%) する未知のオンコセルシド線虫 (Filarioidea) の COI 配列を特徴づけました (AM749265)。

今回我々は、オーストリアの家畜および野生の反芻動物に寄生している吸血カバエにさまざまな病原体の分子的存在を確認した。 収集され調査された 3 種のシラミバエ、L. cervi、M. ovinus、および H. equina は、ヨーロッパに広く分布しています [1, 50]。 本研究では、L. cervi と M. ovinus はそれぞれ主宿主であるシカとヒツジから採取されましたが、H. equina はすべて通性宿主の 1 つであるウシから採取されました [17]。 調査された3つのカバ科の種は、異なる病原体グループに対する総感染率と感染有病率が異なり、少なくとも1つの病原体(病原体グループに関係なく)に対してM.オビヌス標本はL.セルビおよびH.ウマ個体よりも有意に多く感染していた。 、バルトネラ属へ。 そしてトリパノソマチッドへ。 また、ヒツジの羊は、L. cervi および H. equina と比較して、2 つの病原体グループに同時に感染するリスクが高くなりました。 しかし、詳細な分子分析により、各シラミバエ種に感染する異なる病原体(各病原体グループ内)が明らかになりました。 したがって、カバ科とその動物宿主の間で同じ病原体の有病率を比較することは不可能です。 3 つのカバ科の種で同定されたさまざまな病原体、および同定された病原体の媒介者としてのこれらのカバ科の考えられる役割については、以下で説明します。

バルトネラ属最も頻繁に検出された病原体は H. equina および L. cervi で、2 番目に M. ovinus で検出されました。 すべてのバルトネラ属私たちの研究では、家畜および野生の反芻動物に感染する株に関連するバルトネラ系統 II の種に系統発生的に対応していました [51]。 バルトネラ属はほぼ 20 年前に H. equina、L. cervi、M. ovinus で最初に記載され [20, 21]、これらのカバ類の Bartonella ベクターとしての役割を指摘する証拠が増えている [28, 30, 52,53,54,55] 、56、57]。 重要なのは、これまで報告されていなかった 10 種類の異なる Bartonella spp を発見したことです。 アカシカから採取した L. cervi 株。 これらの Bartonella spp. のうち 7 つは、 これらの菌株は、シカの中腸に感染する広範な病原体である B. schoenbuchensis と非常に類似していました (> 99%) [20、28、54]。 Bartonella schoenbuchensis は、アカシカ、ノロジカ、ヘラジカ (Alces alces) など、L. cervi の自然宿主であるさまざまな野生有蹄動物の血液および組織サンプルから分子的に検出されています [1、28、58、59、60、61]。 我々の結果は、B. schoenbuchensis および関連する Bartonella spp. が、 この株はオーストリアの L. cervi で一般的であり、地元の野生のアカシカ集団でも流行している可能性があります。 ダニに刺された後の疲労、筋肉痛、発熱に苦しむ患者の菌血症の報告で説明されているように、B. シェーンブチェンシスが人に伝染する可能性があることを考慮すると、これは One-Health の文脈で注目に値します [62]。 さらに、B. schoenbuchensis は、L. cervi に噛まれたヒトの鹿皮膚炎の病原体であることが示唆されており [20]、人獣共通感染症 Bartonella henselae によって引き起こされる猫ひっかき病と同様の臨床症状を示します [54、63]。 したがって、オーストリアにおける野生のシカ、シカの鹿、および潜在的に他の媒介節足動物における B. シェーンブチェンシスの存在と分布は確認の根拠となります。 さらに、1 つの Bartonella sp. 私たちの研究でシカの鹿から分離された株は、以前に報告されたバルトネラ属と一致しました。 一般的な翼の曲がったコウモリ M. schreibersii で検出された配列 [64]。 このバルトネラ sp. そして我々の研究で同定されたB. シェーンブチェンシス様株は、DNAハプロタイプネットワーク解析においてB. シェーンブチェンシスおよびB. コメリーとともにクラスター化された。 他の 2 つの Bartonella spp. L. cervi で検出された株は別のサブクレードにクラスター化しており、M. ovinus [65] および Bartonella sp. から報告されている Candidatus B. melophagi の配列と非常に類似していました。 ニホンジカから分離された[66]。 バルトネラ属の多様性本研究でシカの血統が検出されたこと、および 2 つの異なる Bartonella 種による同時感染の存在が明らかになりました。 いくつかの個体の系統は、L. cervi が広範囲の Bartonella 種の保菌者であることを示しています。 オーストリアの株。 最近の研究では、いくつかのバルトネラ属の菌が回復したことも報告されています。 このことは、これらの野生有蹄動物がこれらの病原体の保有宿主として機能する可能性を示唆している。 したがって、オーストリアでは野生のシカ科動物がよく発生しており、ヨーロッパではシカ科動物が人間を襲う報告が増えていることを考慮すると[3、6、13、68]、人獣共通感染症であるバルトネラ属菌の監視と同定をさらに拡大することが不可欠である。 シカとシカの個体群で。

Bartonella chomelii は、本研究で牛から収集された H. equina から検出された唯一の Bartonella 種でした。 Bartonella chomelii は、フランスの牛の血液サンプルから別個の Bartonella 種として最初に記載され [69]、その後の各国での報告により、牛 [57, 70, 71] と H. equina [21, 56, 57] の両方にその存在が確認されました。 ]。 最近、分子スクリーニングにより、げっ歯類やイヌから採取されたダニからも B. chomelii が特定されました [72、73]。 対照的に、B. chomelii は、ウマや他のウマ科動物 (H. equina の主な宿主)、または馬に寄生する H. equina では検出されていません [21、71]。 牛が B. chomelii の偶然の宿主である可能性が示唆されており、B. chomelii は Bartonella spp. とより近縁である可能性があります。 B. bovis などの家畜から分離された株よりも、野生の反芻動物からの株の方が有利である [69]。 これがオーストリアにおける B. chomelii の最初の報告であることを考慮すると、牛や野生の反芻動物の集団におけるこの病原体の発生と潜在的な影響を理解するには、さらなる研究が必要です。 これまでの研究では、高齢の牛(2歳以上)や山の牧草地(海抜600m以上)で管理されている家畜ではB. chomeliiの有病率が高いことが示唆されている[57、71]。 本研究では、B. chomelii 陽性の H. equina が、ザルツブルクのホーエ タウエルン アルプスにある山の草原 (海抜約 1000 ~ 1450 m、データは示されていない) で放牧されている牛から収集されました [34]。高山で放牧中の動物はB. chomelii に感染するリスクがある可能性があるが、これはまだ確認されていない。 現在までに、B. chomelii が牛に病気を誘発することは証明されていないが、近縁種である B. bovis の感染はウシ心内膜炎と関連している [74]。

私たちの結果により、Bartonella spp. が存在することが確認されました。 M. ovinus で検出された配列は、羊の群れで最も一般的な病原体の 1 つである Candidatus B. melophagi に属していました [21、53、56]。 かつては反芻動物には伝播しない羊の毛皮の内部共生生物のみであると考えられていた[21]が、ヒツジの血液からの培養成功を含め、羊におけるカンジダトゥス B. メロファギの存在が新たな証拠で確認されており、羊が宿主保有源として機能する可能性があることが示唆されている。この病原体については、おそらくベクターとして M. ovinus が使用されています [55、75]。 しかし、Candidatus B. melophagi が羊に臨床疾患を引き起こす可能性があるかどうか、また M. ovinus がこれらの細菌を伝染させる能力のあるベクターであるかどうかはまだ不明です。 重要なことに、Candidatus B. melophagi は心血管疾患、痛み、疲労などの非特異的症状を示す 2 人のヒト患者の血液サンプルから分離された [76]。 これら2人の患者は家畜や野生動物との頻繁な接触を申告しているにもかかわらず、考えられる感染経路やカンジダトゥス・メロファギ感染と臨床症状との実際の因果関係を示す証拠はなかった[76]。 したがって、Candidatus B. melophagi の人獣共通感染症の可能性と、そのベクターとしての M. ovinus の役割については、さらなる解明が必要です。

本研究では、T. melophagium が M. ovinus で検出された唯一のトリパノソマチド種であり、調査対象の羊の中で感染率が高かった。 Trypanosoma melophagium は 1 世紀以上にわたって羊の子や羊に感染することが知られており [18, 77]、今回の研究は、スコットランドの羊から採取された M. ovinus におけるその高い有病率を確認するこれまでの数少ない分子遺伝学的調査に追加されるものである [22]。クロアチア [25]、そして最近ではチェコ [78]。 系統発生学的研究では、T. melophagium は M. ovinus とヒツジに限定される単一種であると結論付けられています。 それはメガトリパヌム亜属のメンバーであり、これにはウシのトリパノソーマ・タイレリなどの家畜および野生の反芻動物に感染する他の宿主限定病原体が含まれる[25、79]。 初期の研究では、この病原体を保有する M. ovinus に感染した羊では T. melophagium の寄生虫症がないか、または非常に少ないと報告されており、羊の子を経口摂取するだけで羊が T. melophagium に感染する可能性があることが示唆されています [18、25]。 現在までに、T. melophagium が羊に病気を引き起こしたり、他の反芻動物や哺乳類に伝染したりするという証拠はなく、感染した M. ovinus に対して非病原性であることが提案されています [80]。 それにもかかわらず、我々の調査結果は、オーストリアで M. ovinus に感染した羊が T. melophagium に感染している可能性があることを示唆しており、特に羊舎の管理に外部寄生虫駆除剤の使用が少ない、またはまったく使用されていない羊農場 (有機農場など) ではこれを確認する必要があります。 、前述したように[25]。

私たちの研究により、トリパノソーマ属が特定されました。 オーストリアの 2 つの異なる州 (ザルツブルクとブルゲンラント) の牛から収集された 3 頭の H. equina 個体の株。 著者の知る限り、これはトリパノソーマ sp. の最初の報告です。 したがって、動物のトリパノソマチドの新規ベクターとしてのこのカバ科の潜在的な役割を指摘しています。 私たちの系統解析では、このトリパノソーマ sp. この株は、T. theileri グループの配列とともにクラスター化しており、トリパノソーマと非常に類似していました。 米国のオジロジカ (Odocoileus virginianus) から単離された cervi 配列 [81]、ロシアのアブ Hybomitra tarandina、Chrysops divaricatus および Hybomitra muehlfeldi からの T. theileri 様株 [82]、およびツェツェバエGlossinaは中央アフリカ共和国で大騒ぎしている[83]。 オーストリアでの以前の研究では、蚊におけるT. theileri/cervi複合体に属する種の高い蔓延が明らかになり、これらの病原体が動物宿主、潜在的に野生の反芻動物に広範囲に分布していることが示唆されている[84]。 したがって、トリパノソーマ sp. 今回の研究で H. equina で検出された株は T. theileri グループ/複合体に属している可能性があり、さまざまな標的遺伝子を使用して H. equina およびウシのトリパノソマチドをモニタリングする将来の分子研究によって解明される可能性があります。 さらに、オーストリアでは T. タイレリが牛に感染することはまだ報告されていないが、近隣諸国には存在していることを考慮すると [85, 86]、H. equina や tabanid ハエなどの媒介動物だけでなく、家畜にも T. theileri が確認されている。オーストリア産牛は保証されています。 T. theileri 様株などのトリパノソマチッドに関する分子遺伝学的研究は、ポーランドとチェコのシカ科 Lipoptena fortisetosa およ​​び L. cervi でも報告されています [29, 78]。しかし、それらは今回の研究では検出されませんでした。 シカのL. cerviから検出されたトリパノソマチドについて、土壌や水中に存在する非寄生性動植物体(ボドニナ亜目)であるボド種と非常に類似した配列を同定した。 Bodo spp. コウモリの外部寄生虫やオーストラリアの有袋類であるウォイリーのベットンギア・ペニシラテから単離されたが、これらの発見は感染ではなく哺乳類宿主の環境汚染と関連していた[87、88]。 したがって、サンプル中の環境汚染を除外することはできず、Bodo sp.の役割を評価するにはさらなる研究が必要です。 カバ科で。

本研究では、アナプラズマ科は羊の毛皮からのみ検出され、ボルバキア属として同定された。 これらの株は、H. equina や M. ovinus などの海馬動物を含む線虫および節足動物の内部共生生物として知られています [56、65、89、90]。 ボルバキアの 16S 配列は、以前に M. オビヌスから単離された株の配列と同一でした [91]。 現在までに、M. ovinus および他のカバエ科のハエに対するボルバキアの具体的な役割や影響は不明である [90]。 調査した海馬科では病原性アナプラズマ科は検出されなかったが、M. オビナスとL. cerviはそれぞれAnaplasma ovis [23, 92]とA. phagocytophilum [24]に感染する可能性がある。 人獣共通感染症 A. phagocytophilum がオーストリアで野生のシカ科動物とウシ科動物に感染することが確認されていることを考慮すると [33、93、94]、カバエ科のハエとその反芻動物の宿主における病原性アナプラズマ科のモニタリングを拡大するにはさらなる研究が必要である。検出された陽性カバボシドは、A-FGy-1と称されるボレリア分離株および新熱帯性スズメ目ダニから分離されたカンジダトゥス・ボレリア・マフリエンシスに93.7%類似するこれまで報告されていない株に感染したM.オビヌス個体であった[95]。 初期の研究では、ヒトのライム病の原因物質の 1 つである Borrelia burgdorferi sensu lato が M. ovinus に存在することが確認されました [96]。 ボレリア sp. 私たちの研究で得られた 16S 配列は、GenBank にアップロードされた 2 つの B. burgdorferi 配列 (AJ224138 および AJ224134) と 92.9% 類似していました。 B. burgdorferi の潜在的な人獣共通感染症のリスクを考慮すると、新しい研究で Borrelia spp. の正体と分布を特徴付ける必要があります。 オーストリアの羊小屋で。 最後に、1 匹の L. cervi 個体のみがフィラリオデア陽性であり、以前にニホンジカから単離された真皮フィラロイドである Mansonella perforata と 95% の遺伝的類似性を持つ未知のオンコセルシッドの COI 配列を特徴としていた [97, 98]。 このオンコセルシドの配列が M. perforata に属するか、またはこれまで配列決定されていない別のマンソネラ種に属するか、またオーストリアのアカシカとシカの個体群におけるそれらの潜在的な分布を確認する必要があります。

本研究で収集されたカバエ科のハエは、蔓延率が高いと予想される選ばれた農場(羊/牛)での便宜的なサンプリング後に隔離され、結核監視プログラムの一環として狩猟された動物(鹿)であるため、私たちの結果は正確な推定を可能にしません。オーストリアにおけるカバ関連病原体の全国的な蔓延の状況。 しかし、私たちのデータは、さまざまな地理的地域の反芻動物に寄生するシラミバエに病原体が広範囲に存在することを示しています。 したがって、我々の調査結果は、オーストリア、そして潜在的には他のヨーロッパ地域において、カバ科動物および家畜および野生の反芻動物に感染するカバ科動物を媒介とする疾患をより広範囲でモニタリングする必要性を裏付けるものである。 リケッチア属、タイレリア・オヴィス、アシネトバクター属、バチルス属、ブドウ球菌属、青舌ウイルス、国境病など、カバ目ハエで以前に報告されているが本研究では調査されていない他の病原体も、将来の分子調査に含まれる可能性がある。ウイルスおよびCorynebacterium pseudotuberculosis [17]。 さらに、シラミバエの分布と季節動態に対する気候変動の影響を調査する必要があります。 アナプラズマ・ファゴサイトフィルムとバベシア属の最近の確認が示すように、(野生)動物の保有地における潜在的な人獣共通感染症の病原体のモニタリングをオーストリアで拡大する必要があることは明らかである。 野生の有蹄動物で[33]。

この研究は、獣医学的および医学的に重要な感染病原体の媒介者としての吸血カバエの役割の解明に向けた進行中の研究努力に貢献する。 しかし、PCR および配列決定によって確認されたカババエ関連病原体の存在は、これらの病原体に対する調査対象のシラミバエ種の媒介能力を証明するものではなく、それらの媒介能力を示唆するだけである。 ベクター能力とは、ベクター内での病原体の複製を含む、病原体の感染段階を獲得して脊椎動物宿主に伝達する節足動物の能力です。 それには、ベクターから宿主への病原体の伝播、およびその後の感染に関する決定的な実験的、疫学的、臨床的証拠が必要である[99、100]。 カバ科の場合、Bartonella spp. が存在するという証拠があります。 この病原体は、L. cervi 内で垂直感染する可能性があり、反芻動物を吸血している成体のシカの血、蛹、およびまだ吸血を開始していない給餌を受けていない成体ハエから病原体が検出されている[54]。 ただし、L. cervi が Bartonella spp. を伝染できるかどうかは不明です。 脊椎動物宿主への影響はまだ確認されていない。 さらに、L. cervi で検出された病原体 (例: Bartonella spp.) に人獣共通感染症の可能性があるかどうか、これらの感染病原体がオーストリアの野生の反芻動物個体群にどの程度蔓延しているか、そしてこれらの動物が感染を引き起こす可能性のある病原体の保有源として機能する可能性があるかどうか、さらに明らかにする必要がある。ベクトルは deer keds によって作成されました。 これは、作業中または余暇活動(狩猟者、林業労働者、ハイカーなど)中にバルトネラに感染したL. cerviによる咬傷に人がさらされる可能性を考慮すると非常に重要です。

結論として、分子遺伝学的スクリーニングにより、オーストリアの家畜および野生動物に感染するカバ科の 3 種にいくつかの病原体の存在が確認され、その中にはバルトネラ属菌などの新たな人獣共通感染症のリスクを示す可能性のあるものもありました。 我々は、トリパノソーマ属の最初の検出を含む、シラミバエの媒介者の役割を理解するための進行中の研究努力に貢献できる、カバ類におけるいくつかの新規病原体配列を報告する。 H. equina で。 One-Health の文脈において、公衆衛生や動物の健康にとって重要な新興感染病原体の媒介者としてのこれらの外部寄生虫の分布と影響を明らかにするには、海馬科動物および海馬科動物媒介病原体の監視を拡大することが正当化される。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文 [およびその補足情報ファイル] に含まれています。

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財政的支援は、オーストリア連邦教育科学研究省 (Austrian Barcode of Life—Hochschulraum-Strukturmittel) によって提供されました。

この論文のオープンアクセス資金はウィーン獣医科大学 (Vetmeduni Vienna) から提供されました。 我々は、オーストリア連邦教育科学研究省 (Austrian Barcode of Life—Hochschulraum-Strukturmittel) からの財政的支援に感謝します。

ウィーン獣医大学病態生物学部寄生虫学研究所、ウィーン、オーストリア

ミゲル・ペーニャ=エスピノーザ、ダニエル・エム、ビタ・シャヒ=バロー、ドミニク・ベラー、ゲオルグ・G・シャワー、ララ・ファン・デル・フロート、マリア・S・ウンターケフラー、ハンス=ペーター・フューラー

オーストリア保健・食品安全庁 (AGES)、研究サービス、オーストリア、ウィーン

ゲオルグ・G・シャワー

オーストリア保健・食品安全庁 (AGES)、獣医疾病管理研究所、インスブルック、オーストリア

ヴァルター・グラヴィシュニッヒ

Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH、カトリーネンホフ研究センター、ロールドルフ、ドイツ

シュテフェン・レーバイン

ウィーン獣医科大学病理学研究所、ウィーン、オーストリア

ヨーゼフ・ハール

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HPF は研究を計画し、資金を調達しました。 DE、BSB、LvdV、MPE は分子遺伝学的研究を実施しました。 JH はトリパノソマチダ プライマーを設計しました。 DB、GD、WG、SR はカバ科のハエの野外サンプリングを担当しました。 JH と MSU は系統解析を実施しました。 MPE は最初の草案を書きました。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

ハンス・ペーター・フューラーへの通信。

適用できない。

適用できない。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

選択されたバルトネラ属の gltA 配列を特徴とするベイジアン推論ツリーノードは、ベイジアン推論の事後確率と最尤ブートストラップ値でマークされます。 赤いバーでマークされたクレードは、この研究で得られた配列を含む中央結合ハプロタイプ ネットワークの計算に使用されました。 スケールバーは、適用された配列進化モデルに従って、部位ごとに予想される置換の平均数を示します。 図S2。 選択されたトリパノソーマ属の 18S rRNA 配列を特徴とするベイジアン推論ツリーノードは、ベイジアン推論の事後確率と最尤ブートストラップ値でマークされます。 赤いバーでマークされたクレードは、この研究で得られた配列を含む中央結合ハプロタイプ ネットワークの計算に使用されました。 スケールバーは、適用された配列進化モデルに従って、部位ごとに予想される置換の平均数を示します。

Bartonella spp.のいもち病分析配列はオーストリアの家畜および野生の反芻動物から収集されたケッズから得られた。

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転載と許可

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受信日: 2023 年 3 月 1 日

受理日: 2023 年 5 月 14 日

公開日: 2023 年 6 月 2 日

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