血漿メタボロミクスにより、突然離乳した子牛の炭水化物、脂質、タンパク質の代謝における大きな変化が明らかになりました

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8176 (2023) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

1H NMR ベースのメタボロミクスを使用して、肉用子牛の血液メタボロームに対する突然の離乳の影響を研究しました。 20 頭のアンガス子牛 (体重 258 ± 5 kg、生後 5 ～ 6 か月) を、母牛と一緒に放牧を続ける非離乳 (NW) グループ、または母牛から突然離れて放牧された離乳 (W) グループにランダムに割り当てました。研究の日0に別のパドック。 体重、行動、コルチゾールとメタボロミクスのための血液サンプルを研究の 0、1、2、7、14 日目に測定しました。 1 日目と 2 日目では、W 子牛は草を食べたり反芻する時間が減り、発声や歩行に多くの時間を費やし、コルチゾール、NEFA、3-ヒドロキシ酪酸、ベタイン、クレアチン、フェニルアラニンの濃度が高く、チロシンの量は少なかった (P< 0.05）北西部の子牛と比較。 14 日目の NW 子牛と比較して、W 子牛は酢酸塩、グルコース、アラントイン、クレアチニン、クレアチン、クレアチンリン酸、グルタミン酸塩、3-ヒドロキシ酪酸塩、3-ヒドロキシイソ酪酸塩、および 7 つの AA (アラニン、グルタミン酸塩) の相対量が多かった (P < 0.01)。 、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、スレオニン、バリン）しかし、低密度および超低密度脂質、および不飽和脂質の相対的な存在量は少ない（P < 0.05）。 PCA と OPLS-DA はどちらも、0 日目ではグループ間のクラスター化や区別を示さず、14 日目まで発散が増加していました。血液メタボロミクスは、突然の離乳後の最初の 2 日間およびそれ以降の子牛におけるストレスの急性影響を定量化するのに有用なツールです。牛乳摂取の停止と飼料摂取への依存度の増加による栄養の変化による、炭水化物、脂質、タンパク質の代謝の短期的な変化。

生まれたばかりの子牛と反芻前の子牛の栄養要件は、未発達の第一胃を迂回する牛乳から吸収されるタンパク質、脂肪、炭水化物（主に乳糖）、ビタミン、ミネラルだけで満たされています1。 牧草地で育てられた子牛の前反芻期から反芻期への移行は、固形飼料の摂取とルーメン発酵が増加し、微生物タンパク質と VFA2,3 への依存度が高まるにつれて徐々に起こります。 この反芻動物の最も顕著な特徴の 1 つは、プロピオン酸、乳酸、AA1 からの高い糖新生能です。 子牛を生後 3 ～ 6 か月で母牛から突然引き離す（離乳）ことは、肉牛生産システムにおける標準的な慣行です4。 乳離れした子牛は、行動、代謝、生理学的、免疫学的変化を引き起こす栄養的、社会的、心理的ストレスを経験する可能性があります5,6。 したがって、離乳の実践では、動物福祉、代謝機能、子牛の栄養要件を考慮する必要があります2。 これまでの研究は、離乳後の最初の 48 時間でより明らかとなる、離乳した子牛の行動、ストレスホルモン、免疫学の変化に焦点を当ててきました5、7、8、9。 コルチゾールなどのストレスホルモンの異化作用は、離乳後の血中 NEFA 濃度の上昇と ADG の一部の低下を説明できます 10,11。 しかし、牧草地での子牛の牛乳摂取の停止は、飼料中の低濃度により食事性脂肪が減少する一方、繊維質と第一胃発酵が増加するため、長期的な代謝変化を引き起こすと予想されます。 驚くべきことに、離乳後の放牧子牛の代謝機能の変化についてはほとんど知られていない。 この情報は、代謝ストレスを軽減し、福祉を改善し、離乳後の動物生産量の減少を最小限に抑えるための新しい戦略を開発するために使用できる可能性があります。

代謝機能は、細胞、組織、臓器の機能に影響を与える脂質、糖、AA などの代謝産物で構成される血液メタボロームに反映されます 12,13。 メタボロームはゲノム、トランスクリプトーム、プロテオームの下流にあり、表現型に最も近い「オミック」です。 これは、メタボロームが生物学的機能の変化の最良の指標である可能性があるという示唆につながりました 14、15、16。 血液メタボロームのもう 1 つの重要な特徴は、代謝に影響を与える外部要因 (食事など) と内部要因 (遺伝子型など) の統合を表すことです 15。 ブタでは、離乳は代謝機能と血液メタボロームの両方の変化と関連しており、これらの変化はアルギニンの補給によって部分的に対抗できる可能性があります17。 以前の研究では、初乳を与えられた新生子牛では、血清中のグルタミン酸、ヒスチジン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリンの存在量が増加し、グルタミンが減少したことが報告されています13。 しかし、商業条件下での離乳後の放牧肉用子牛の血液メタボロームの変化を評価した研究は発表されていません。

本研究の目的は、突然の離乳を受けたアンガス牛の子牛の血液メタボロームの変化を特徴付けることでした。 この情報は、肉用子牛の突然の離乳が代謝に及ぼす影響についての理解を深め、移行を管理するための新しい戦略を提供する可能性があります。 この仮説は、肉用子牛の突然の離乳は、血液メタボロームに反映される代謝反応を引き起こすストレスや栄養変化と関連しているというものでした。

この研究は、シドニー大学動物倫理委員会から動物倫理の承認を得ました: プロトコル 767。すべての方法は、倫理承認および 1985 年動物研究法 (https://www. dpi.nsw.gov.au/about-us/legislation/list/animal-research)、2021 年動物研究規制 (https://legislation.nsw.gov.au/view/pdf/asmade/sl-2021-477)科学的目的のための動物の管理と使用に関するオーストラリアの規範、2013 年第 8 版 (https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-Purposes) ）。

20頭の経産アンガス牛とその子牛（生後5～6か月）は、シドニー大学ジョン・パイ農場（オーストラリア、ニューサウスウェールズ州グリーンデール）で標準的な放牧条件と管理下で維持された。 牧草地はパスパラム (Paspalum dilatatum) が大半を占め、チコリ (Cichorium intybus)、オオバコ (Plantago lanceolata)、レッドクローバー (Trifolium pratense)、およびシロツメクサ (Trifolium repens) の密度は比較的低く、CP 10.7%、NDF 60.7%、 20.6%のADF。 子牛は春生まれで、生まれた時から母牛と一緒に過ごしました。

0 日目に、子牛の体重を測定し、性別でブロックし、母牛と一緒にいた非離乳グループ (NW; n = 10; 体重 257 ± 6 kg)、または母牛から突然離れた離乳グループにランダムに割り当てました。 (W; n = 10; 体重 258 ± 5 kg)、母動物との視覚的または聴覚的接触がない状態で別のパドックに送られました。 各グループには 7 頭の雄 (去勢されていない) 子牛と 3 頭の雌の子牛がいました。 2 つのパドックの牧草の組成と量は同様でした。 これは、研究の開始時（0日目）と終了時（14日目）における牧草のサンプリングと分析によって検証されました。 この目的のために、10 個の四角形 (0.5 m × 0.5 m) を各パドックにランダムに配置し、四角形内の飼料を地面の高さで切断し、65 °C で 48 時間乾燥させ、重量を量って利用可能な飼料バイオマスを計算しました。 子牛の 2 つのグループは、研究の 0 日目から研究の終了 (14 日目) までそれぞれのパドックに留まりました。 0、2、7、および 14 日目にすべての子牛の体重を記録しました。血液サンプルは、0、1、2、7 日目に EDTA を含む真空チューブ (BD Vacutainer、ベクトン ディッキンソン、ニュージャージー州、米国) を使用して頸静脈穿刺によって収集されました。午前 9 時から午前 10 時までは 14 時。 サンプルを4℃で約30分間冷蔵し、遠心分離し（2000×gで30分間）、血漿をメタボロミクス分析まで-80℃で保存した。

行動は、離乳日（0日目）から-2、-1、0、1、2、7、および14日目に各動物について3分間隔でスキャンサンプリングを使用して測定されました。 観察は、動物の番号、日付、時刻（3分間隔）が記載された記録シートを使用して現場で直接行われましたが、動物が行った行動は、午前7時から午前9時、午前11時までの期間に2人の観察者によって記録されました。記録された行動には、記述されているように、放牧、反芻、休息、授乳、歩行、発声（モーイング）、および飲酒が含まれます。

血漿中のコルチゾール濃度は、製造業者の指示に従って単一アッセイで測定した（ADVIA Centaur® コルチゾールアッセイ; Siemens Healthcare Pty Ltd、Bayswater、Victoria、Australia）。 アッセイ感度は 2.0 ng/mL、アッセイ内変動係数は 3.5% でした。 NEFA は、牛で以前に使用された単一のアッセイ (Randox Australia Pty Ltd、パラマッタ、オーストラリア) でも測定されました 20。 アッセイ感度は 0.03 mEq/L、アッセイ内変動係数は 1.4% でした。

1H NMR のサンプル調製および取得方法は、公開されているプロトコル 21、22 に基づいていました。 血漿を室温で解凍し、アリコート (350 μL) を、0.075 M NaH2PO4、pH = 7.4 (KOH 調整済み)、0.1% ナトリウムを含む水性 (80% H2O:20% D2O) リン酸緩衝液 350 μL と混合しました。アジド、1 mM 3-トリメチルシリル-1-[2,2,3,3,-2H4] プロピオネート (TSP)、エッペンドルフ チューブ。 サンプルをボルテックスに 30 秒間置き、6000 xg で 10 分間遠心分離しました。 1H NMR 分析のために、上清のアリコート (600 μL) を 5 mm NMR チューブに移しました。

１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、５ｍｍ広帯域逆配置プローブを備えた３１０Ｋで１Ｈ、４００．１３ＭＨｚで動作するＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ４００ＭＨｚ分光計を用いて取得した。 サンプルはランダムな順序で分析され、SampleCase 24 サンプル自動化システムを使用して自動化されました。 サンプルは、NOESYPRESAT パルス シーケンス (160 トランジェント) および事前飽和を伴う Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) スピン エコー シーケンス (160 トランジェント) を使用した水抑制 1D NMR スペクトルを使用して分析されました。 溶媒（水）共鳴の照射は、すべてのスペクトルの飽和前遅延（2.0 秒）中に適用され、水抑制 1D NMR スペクトルについては混合時間（0.1 秒）にも適用されました。 90°パルス（約12μs）、パルス周波数オフセット（約1880Hz）、受信機ゲイン（90.5）、およびパルスパワーを含むパルスシーケンスパラメータは、代表的なサンプルで最適化され、分析されたコホートに対して一定に設定されました。 スペクトル幅は、NOESY 実験では 30 ppm、CPMG 実験では 20 ppm でした。 結果として生じるフーリエ誘導減衰は、フーリエ変換の前に 0.3 Hz の指数関数的な線幅拡大で処理され、約 32 k の実データ ポイントで収集されました。

MATLAB 7.0 ソフトウェア (MathWorks、Natick、MA) を使用して、1H NMR 生データセットを自動的に位相調整し、ベースライン補正し、α-C1H グルコースダブレット (5.23 ppm) を参照しました。 サンプル間の分析変動を減らすために、残留水シグナル (4.67 ～ 4.98 ppm) はデータセットから切り捨てられました。 確率商の正規化はコホート全体で実行されました23。 内因性代謝産物の割り当ては、Chenomx® (Chenomx Inc.、エドモントン、アラバマ州、カナダ) を使用し、出版文献、オンライン リソース、およびスパイク実験を参照して、高い信頼性で行われました 24、25、26。 変数の統計的再結合 27 を使用して、前処理された NMR スペクトル データを、相対的な代謝物の存在量を表す特徴またはピークにクラスター化しました。

1H NMR データの処理に続いて、MATLAB 7.0 と SAS (SAS Inc、ノースカロライナ州ケアリー) の両方を使用して多変量統計解析を実行しました。 行動、ADG、コルチゾール、NEFA、および特定された代謝産物の相対存在量に関するデータは、固定効果として治療、子牛のランダム効果を受ける反復測定として時間を、および治療×時間を用いた混合効果線形回帰モデルを使用して分析されました。交流。 性別はもともとそれぞれの相互作用とともにモデルに含まれていましたが、これは重要ではないことが判明したため (P > 0.05)、モデルから削除されました。 空間パワー共分散構造は、繰り返される測定間の不均等な距離を考慮した最も低いベイズ情報量基準に基づいて選択されました。 すべての変数と残差は、正規性、ラ​​ンダム分布、平均ゼロについてテストされました。 コルチゾールおよびNEFAのデータは、分布を正規化するために分析前にlog10に変換されました。 行動データを使用して、各動物および日ごとの各行動の観察のパーセンテージを計算し、統計分析の前に逆正弦平方根を使用してデータを変換しました。 治療平均間の差異は、一対の比較を使用して各時点内で計算されました。

正規化されたスペクトルの主成分分析 (PCA) を使用して、潜在的な異常なスペクトル (外れ値) を特定し、代謝産物プロファイルの明らかなパターンや傾向を検出しました 28。 異常値は検出されなかったので、主成分をプロットした後、各時点での 26 の同定された代謝物の相対存在量を使用して 2 回目の PCA 分析を実行し、治療グループのクラスタリングを検出しました。 直交部分最小二乗判別分析 (OPLS-DA) を使用して、治療グループ間で動物を識別しました (教師付き分類)。 これらの OPLS-DA モデルは、各動物を特定の治療グループに割り当てることを可能にする代謝産物のスペクトルまたは存在量を特定します。 生成された OPLS-DA モデルは、教師ありモデルの妥当性を評価するために 1000 回の相互検証順列テストを通じて実行されました 28、29、30、31。 OPLS-DA モデルは、データセットが離乳グループ間の動物の識別に優れているかどうかを判断するために、1H NMR 正規化スペクトル全体と 26 個の同定された代謝産物の両方から生成されました。 OPLS-DA モデルの予測能力は Q2 値によって測定されました30。

開始時（それぞれ2130±217および555±67kg DM）または終了時（1753±105および668±47kg DM）における緑または乾燥牧草バイオマスでの処理間に有意差は見られなかった（P > 0.05;データは示さず）。 、それぞれ）トライアルの。 ０日目と１４日目のＢＷは、治療間で差がなかった（Ｐ＞０．０５）（データは示さず）。 全体的な ADG は、W 子牛 (0.74 ± 0.084 kg/日) と比較して、NW 子牛 (1.05 ± 0.079 kg/日) の方が大きかった (P = 0.014)。 治療×日の相互作用 (P < 0.001) は、W 子牛は 0 日目と 2 日目の間に体重が減少したが、NW 子牛はこの期間に体重が増加したことを示しました (P = 0.06; 図 1)。 2 日目と 7 日目の間の ADG は、NW 子牛と比較して W で大きく (P < 0.05)、7 日目と 14 日目の間では反対の効果が見られました (P < 0.05; 図 1)。 すべての行動は、治療×日の相互作用を示しました（P < 0.001; 図 2）。 W 子牛と NW 子牛はどちらも、d − 2 と − 1 の各活動に同様の時間を費やしました (P > 0.10)。 対照的に、W 子牛は NW 子牛と比較して、0 日目 (P < 0.05)、1 日目 (P = 0.06)、7 日目 (P < 0.05) では放牧に費やす時間が短かったが、2 日目では放牧時間が長くなりました (P < 0.05)。 0日、1日、2日目において、W子牛はNW子牛と比較して、反芻する時間が短く、発声と歩行に多くの時間を費やしました（P<0.05;図2）。 14 日目の時点で、W 子牛と NW 子牛の間に行動上の差異はありませんでした (P > 0.05)。ただし、NW 子牛と比較して、W 牛では母動物からの乳を飲む時間が短かったことと、歩行時間が長かったことがそれぞれ異なりました (P < 0.05)。

乳離れしたアンガス子牛と乳離れしていないアンガス子牛の成長率。 離乳は 0 日目でした。W は離乳の主効果です。 D は離乳に対する Day の主効果です。 1日以内の†、*、**、***の値は、治療群間で異なるか、異なる傾向がありました（P ≤ 0.10、P ≤ 0.05、P ≤ 0.01、P ≤ 0.001）。

離乳したアンガス牛子牛と離乳していないアンガス牛の子牛の離乳時との相対的な行動（0日目は離乳後）。 W は離乳の主効果です。 D は離乳に対する Day の主効果です。 1日以内の†、*、**、***の値は治療群間で異なります(P ≤ 0.10、P ≤ 0.05、P ≤ 0.01、P ≤ 0.001)。

コルチゾール (P < 0.05) と NEFA (P < 0.001; 図 3) の血漿濃度について、離乳 × 日の相互作用が観察されました。 W の子牛は、NW の子牛と比較して、1 日目 (P < 0.10) および 2 日目 (P < 0.01) でコルチゾール濃度が高くなる傾向がありましたが、7 日目と 14 日目では群間の差は観察されませんでした (P > 0.10)。 NEFA の血漿中濃度は、1 日目、2 日目、および 7 日目では、NW の子牛と比較して W で高く (P < 0.01) (P < 0.05)、0 日目と 14 日目では差はありませんでした (P > 0.10; 図 3)。 。

離乳した子牛と離乳していないアンガス牛子牛の、0日目の離乳時間と比較したコルチゾールと非エステル化脂肪酸（NEFA）の血中濃度（離乳前の血液サンプル）。 W は離乳の主効果です。 D は離乳に対する Day の主効果です。 1日以内の†、*、**、***の値は治療群間で異なります(P ≤ 0.10、P ≤ 0.05、P ≤ 0.01、P ≤ 0.001)。

合計 26 の代謝産物が 1H NMR スペクトルから同定されました (図 4、5、および 6)。 NW 子牛の代謝産物の相対濃度は時間の経過とともに変化しませんでしたが (P > 0.05)、W の子牛ではすべての代謝産物が時間の経過とともに変化しました (P < 0.05)。 NW 子牛と W 子牛の違いは、26 種類の代謝物のうち 24 種類で離乳後に現れました。 例外は、治療×日の相互作用を示さなかったAAヒスチジンとグルタミンでした(P > 0.05)。 一部の代謝物は、離乳グループ間で 1 日目と 2 日目に最大の差異を示し、その他の代謝物は 14 日目に最大の差異を示しました (図 4、5、および 6)。 離乳した子牛は、1 日目または 2 日目では新西州の子牛と比較してチロシンの量が少なく、イソロイシンの量が多かったですが (P < 0.10)、0 日目、7 日目、および 14 日目では差はありませんでした (P > 0.10)。 ベタインは、2 日目および 7 日目では、NW 子牛と比較して W で多かった (P < 0.05; 図 6)。 他の代謝産物の相対量は、7 日目または 14 日目、または 7 日目と 14 日目の両方でのみ、NW 子牛と比較して W で多かった。これには、AA (バリン、アラニン、スレオニン、ロイシン、リジン、スレオニン)、アラントイン、酢酸塩、糖タンパク質。 また、NW 子牛と比較して W の VLDL/LDL および不飽和脂質の存在量が低い (P < 0.05)。 別のグループの代謝物は、1 日目または 2 日目から 14 日目まで、NW 子牛と比較して、フェニルアラニン、グルタミン酸、クレアチニン、クレアチン、クレアチンリン酸、グルコース、3-ヒドロキシ酪酸、および 3-ヒドロキシイソ酪酸を含む、W の相対存在量がより多かった（P < 0.10;図4、5、6）。

離乳0日目の離乳時間に対する、離乳した子牛と離乳していないアンガス牛子牛の血漿代謝産物の相対濃度（離乳前の血液サンプル）。 W は離乳の主効果です。 D は離乳に対する Day の主効果です。 1日以内の†、*、**、***の値は治療群間で異なります(P ≤ 0.10、P ≤ 0.05、P ≤ 0.01、P ≤ 0.001)。

離乳0日目の離乳時間に対する、離乳した子牛と離乳していないアンガス牛子牛の血漿代謝産物の相対濃度（離乳前の血液サンプル）。 W は離乳の主効果です。 D は離乳に対する Day の主効果です。 1日以内の†、*、**、***の値は治療群間で異なります(P ≤ 0.10、P ≤ 0.05、P ≤ 0.01、P ≤ 0.001)。

離乳0日目の離乳時間に対する、離乳した子牛と離乳していないアンガス牛子牛の血漿代謝産物の相対濃度（離乳前の血液サンプル）。 W は離乳の主効果です。 D は離乳に対する Day の主効果です。 1日以内の†、*、**、***の値は治療群間で異なります(P ≤ 0.10、P ≤ 0.05、P ≤ 0.01、P ≤ 0.001)。

図 7 の 26 個の同定された代謝物を予測因子として使用した教師なし PCA プロットは、第 2 主成分 (PC2、Y) に対してプロットされたデータの変動を可能な限り考慮した第 1 主成分 (PC1、X 軸) を表しています。 -軸）。 PC2 は、前の成分と直交するという制約の下で、データ内の可能な最大の分散を考慮します。 最初の 2 人の PC によって説明された分散は、離乳に関してどの日でも 50% を超えていました (図 7)。 離乳前（0日）、PCAは、2つのグループの子牛の重複によって示されるように、メタボロームに基づいてNW子牛とW子牛の間の明らかな区別を示さなかった（図7A）。 離乳後 1 日目に、PCA は NW 子牛と W 子牛の間の分離を示しました (図 7B)。 この分離は、d 2 (図7C)、d 7 (図7D)、およびd 14 (図7E)でも明らかなままであった。

離乳していない子牛（白丸）および離乳した子牛（黒丸）のアンガス子牛の 1H NMR スペクトルの主成分分析 (A) 急激な離乳直前、(B) d 1、(C) d 2、(D) d 7、 (E) 離乳後 14 日目。 楕円は、d 0 でのクラスタリングの欠如と、離乳後の異なる日における非離乳グループ (点線の輪郭) と離乳グループ (実線の輪郭) のクラスタリングを強調するのに役立ちます。

各サンプルのスペクトル全体を使用したマルチベクトル教師付き OPLS-DA 散布図でも、時間と離乳状態に応じた子牛の血液メタボロームの違いが強調されました (図 8)。 血液メタボロームは離乳後 1 日目に顕著に変化し、それは離乳後 14 日目まで続きました。 W 子牛と NW 子牛の間の分離が時間の経過とともに増加することは、離乳後の時間の経過とともにメタボロームが分岐し続けたことを示しています。

アンガス子牛の代謝型の安定性は、時間および離乳処理群（離乳または非離乳子牛）に関連します。 離乳していない子牛（白丸）と離乳した子牛（黒丸）のアンガス子牛の血漿（時点、濃青色から赤色）の 1H NMR スペクトルから得られた 2 次元 OPLS モデル スコア プロット（2 つの予測成分と 5 つの直交成分） 。 時点は、離乳後 0 (紫)、1 (青)、2 (緑)、7 (オレンジ)、および 14 (赤) です。

その後、採血日ごとに、1H NMR スペクトル全体または 26 個の同定された代謝産物のいずれかを使用して、個別の識別モデルを作成しました (表 1)。 d 0 での Q2 値は、OPLS-DA には子牛が NW グループに属するか W グループに属するかについての予測的妥当性がないことが示されました (表 1)。 d 1 ～ 14 の Q2 値は > 0.40 であり、OPLS-DA がスペクトル全体と代謝産物の相対存在量の両方を使用して NW 子牛と W 子牛を正確に識別できることが確認されました (表 1)。 代謝産物を使用した予測は、Q2 がわずかに高いため、スペクトル全体よりわずかに優れたパフォーマンスを示しているようです。 ランダム順列テストにより、すべてのモデルが離乳状態の変化後に治療グループ間を区別できることが確認されました。

本研究は、1H NMRを使用して測定され、ADG、コルチゾール、NEFA、行動などのストレスとエネルギーバランスの伝統的な測定によって裏付けられた、牛子牛の血液メタボロームに対する急激な離乳の影響を特徴付けることを目的としました。 各サンプリング日における PCA は、教師なし分類法としてのメタボロームに従って、子牛が W 群または NW 群にクラスター化する可能性を評価するために実行されました。 この分析により、離乳が代謝機能に大きな影響を及ぼし、純粋に血液メタボロームに基づいてグループを分離できることが確認されました。 これらの結果は教師付き分類 (OPLS-DA) を使用してさらに確認され、NMR スペクトル全体または同定された代謝物のいずれかを使用して正確な識別が達成できることが示されました。 さらに、PCA 分析と OPLS-DA 分析の両方により、W 子牛と NW 子牛のメタボロームは離乳前には差がなかったが、離乳時からグループの明らかな分岐が存在したことが実証されました。 これは、著者の知る限り、離乳後の子牛の血液メタボロームの変化を評価するために発表された最初の研究です。 NW 子牛と W 子牛の間の血液メタボロームの違いは、牧草総量や利用可能な緑のバイオマスでは説明されず、2 つのグループで同様でした。 したがって、W子牛で観察された代謝変化は、生理学的および心理的ストレス要因、摂取した栄養素の種類、子牛を母牛から物理的に引き離した後の乳摂取の中止による代謝機能の変化の組み合わせによるものと考えられます。哺乳の停止、ダムからの社会的支援の除去、社会組織の変化2,4,32。 本研究の子牛は生後 5 ～ 6 か月であり、この年齢で入手可能な固形飼料によって網状ルーメンの発達が完了すると予想されることに留意することが重要です 33。 しかし、本研究中、子牛は依然として乳を飲み続けており、消費されたエネルギーと栄養素の一部が母牛の乳から得られたことを示唆しています。 摂取された牛乳は第一胃を迂回して第四胃で消化され、下部消化管で吸収されます33。 0 日目から 14 日目までの W 子牛における VLDL/LDL および不飽和脂質の血漿相対濃度の減少は、乳からの脂肪摂取と飼料摂取への依存の急激な減少を反映している可能性があります。 飼料の脂肪含有量は非常に低く (DM の約 1%)、牛乳の脂肪含有量は DM33 の約 30% と高くなります。

脂質の長期的な減少とは対照的に、本研究における離乳後の最初の 1 週間における W 子牛と NW 子牛の顕著な差は、ストレス ホルモンによる生理学的変化を反映している可能性があります。 以前の研究では、離乳時のストレスは急性であり、条件が適切であれば短期間（最長 48 時間）であると結論付けられています2。 ADG、コルチゾール、および行動（発声、歩行、放牧）に関する本研究の結果は、これらの変数が以前の研究と一致して7日目までに離乳前の値に戻ったため、この観察を裏付けています19。 血中コルチゾールの上昇は、代謝 34,35 や免疫機能 5,6,36 を含む牛の幅広い生理学的プロセスに影響を与えます。 本研究では、NEFA、ベタイン、3-ヒドロキシ酪酸の濃度も離乳後 2 日目にピークに達しましたが、それぞれ 7 日目と 14 日目まで上昇したままでした。 対照的に、ストレスを示すコルチゾールと行動は、7日目までにすでに離乳前の値に戻っていました。牛のNEFA、ベタイン、および3-ヒドロキシ酪酸の上昇は、一般にストレス媒介によって引き起こされる可能性のある脂肪分解と体脂肪動員の増加を反映しています。糖質コルチコイド、高いエネルギー需要、または負のエネルギーバランス2,37。 W 子牛は離乳後 d 2 で体重が減少しましたが、NW 子牛と W 子牛は両方ともその後体重が増加し、負のエネルギーバランスがなかったことを示しています。 したがって、W 子牛の ADG が NW 子牛と比較して低いという発見は、エネルギー利用に対するコルチゾール媒介の影響、または栄養素摂取量の低下による栄養上の課題、あるいはその両方を示唆しています。

W子牛のNEFA量の時間的傾向は脂質のそれとは著しく異なり、これらの化合物は両方とも脂質代謝の一部であるにもかかわらず、同じ代謝経路を共有していないことを示唆しています。 この推測は、代用乳中の脂肪濃度の増加が血中 NEFA および子牛のトリグリセリドに及ぼす影響がないことによって裏付けられています 38。 さらに、本研究では NEFA と脂質の間に相関関係はありませんでした (P > 0.05; データは示さず)。 したがって、1H NMR で測定される脂質は食事源に由来する可能性があるのに対し、NEFA は脂肪動員に由来する可能性があります。

ベタインは、タンパク質と脂質の代謝に関与し、細胞をストレスから保護する抗酸化能力を向上させ、細胞内で浸透圧調節特性を有するメチル供与体です39。 移行期の乳牛では、負のエネルギーバランス下でベタインの生産が増加し、血漿グルコース濃度が低下すると脂肪分解によるエネルギー生産をサポートするためにNEFAと3-ヒドロキシ酪酸の血漿濃度が増加しました40。 さらに、熱ストレス期間中のベタイン補給により、乳牛の乳生産量が改善され 41,42、肉牛の成長と脂肪の蓄積が改善されました 43,44。 本研究の W 子牛はベタイン生産を増加させて脂肪分解とトリグリセリドの酸化を改善し、従って離乳時のストレス反応に必要なエネルギーを供給したと考えられます。 しかし、移行期乳牛とは異なり、子牛は負のエネルギーバランスになく、NW子牛と比較してWではグルコース濃度が増加したため、今回の発見は授乳中の乳牛とは異なります。

本研究では、W子牛では離乳後最初の2日間でチロシンの相対量が減少しており、チロシンが離乳に対するストレス反応にも重要な役割を果たしていることが示唆された。 チロシンは、ドーパミン、ノルエピネフリン、エピネフリンなど、ストレス反応に関与するカテコールアミン経路のいくつかの神経伝達物質の前駆体です45、46、47。 離乳に対する急性ストレス反応により、チロシンの需要と利用が増加し、その結果、血中濃度が低下したと仮説が立てられています。 しかし、牛のストレス反応におけるチロシンの役割に関する研究は不足しており、より多くの情報に基づいた結論を導くためにはさらなる研究が必要です。

糖タンパク質は、炎症、感染、ストレス、外傷によって増加する急性期タンパク質です48。 NW 子牛と比較した W 子牛の糖タンパク質の相対量の増加は、突然の離乳に対する W 子牛の一般的なストレス反応を反映している可能性があります。 ただし、急性期のタンパク質は一般に特異的ではなく、NMR で測定された糖タンパク質が ELISA やクロマトグラフィーなどの他の技術で測定された糖タンパク質と同じであるかどうかは不明です。 それにもかかわらず、これらの発見は、異なる反応や代謝経路を示す複数の代謝産物を測定する血液メタボロミクスの可能性を実証しているため、重要です。

離乳時の急性ストレスを反映していると思われる代謝物とは対照的に、バリン、アラニン、ロイシン、リジン、クレアチニン、クレアチン、クレアチンリン酸、酢酸、ブドウ糖などの他の代謝物は、14日目に最大の相対濃度に達しました。 これらの代謝産物は、食事の変化、慢性的なストレス、またはその両方による代謝機能の変化を反映していることが示唆されています。 本研究において、時間の経過とともにNW子牛のメタボロームに有意な変化が生じなかったという事実は、これらの代謝物がW子牛の代謝調整を反映していることを示唆しています。 しかし、本研究は離乳後 14 日までのメタボロームのみを測定したものであり、これらの変化が牛乳摂取の中止に伴う長期的な代謝変化の結果であるかどうかを判断するために、離乳後より長期間にわたって代謝物を測定することは興味深いであろう。あるいは、短期的な代謝調整または急性ストレス反応の結果です。

NW子牛と比較したW頭の循環グルコースの急激かつ持続的な増加は、ストレス反応または乳からではなく第一胃の揮発性脂肪酸と糖新生AAからより多くのエネルギーを生産するための代謝調整による糖新生の増加を反映していると解釈できます。両方。 一方で、グルココルチコイドは、肝臓と筋肉のグリコーゲン貯蔵の動員を通じて、ストレス時の糖生成代謝を促進します45、49、50、51。 しかし、本研究では、コルチゾールとストレス行動は離乳後 2 日目にピークに達し、7 日目までに離乳前の値に戻りましたが、グルコースは 14 日目にピークに達しました。 一方、糖新生の速度は、前反芻期から反芻期に移行するにつれて増加します1。 本研究のすべての子牛は中品質の牧草を摂取したため、食餌性グルコースは最小限であると予想されました。 肝臓における糖新生は、第一胃から吸収されるプロピオン酸、乳糖、乳酸塩、アラニンやグルタミン1などの糖原性AA、バリン、イソロイシン、スレオニン47によってサポートされている可能性があります。 アラニン、バリン、スレオニンは、本研究ではグルコースと同様に 14 日目まで増加して糖新生をサポートしているようです。 NMR スペクトルではプロピオン酸は同定されませんでしたが、酢酸塩は 7 日目と 14 日目に大きな増加を示しました。しかし、乳酸、グルタミン、イソロイシンは 7 日目と 14 日目で W 子牛と NW 子牛の間で差異を示さなかったのです。

酢酸塩は、第一胃内での高飼料飼料の発酵中に高い割合で生成される VFA であり、そこで血流に吸収されます 52。 したがって、7 日目および 14 日目の NW 子牛と比較して W 子牛の酢酸塩の量が多かったのは、W 子牛の飼料と繊維の摂取量が多かった (部分的に牛乳を代替) ためである可能性があります。 吸収後、酢酸塩は 3-ヒドロキシ酪酸塩に変換されたり、トリカルボン酸回路 (TCA) を介して酸化されたり、脂肪酸合成に使用されたりすることがあります 53。 しかし、本研究では、酢酸塩の濃度は 3-ヒドロキシ酪酸塩と同時にピークに達しませんでした。

本研究における W 子牛の 3-ヒドロキシ酪酸の時間的傾向は、2 日目にピークに達したが 14 日目まで上昇したままであったため、興味深いものでした。この代謝産物は、脂肪分解中の脂肪酸の不完全な酸化、または脂肪分解中の脂肪酸の不完全な酸化、または脂肪からの吸収中の酢酸の変換のいずれかに由来する可能性があります。第一胃54。 したがって、W子牛で観察された傾向は両方の代謝プロセスを反映しており、離乳後最初の2日間の3-ヒドロキシ酪酸の多量は、急性ストレス反応中に動員された肝臓の不完全な脂肪酸酸化（NEFA）を反映している可能性があります。 3-ヒドロキシ酪酸塩の相対的な豊富さは、飼料摂取量の増加により第一胃内で吸収された酢酸塩の変換によって維持された可能性があります。 これは、輸送および離乳後の産後の乳牛または子牛において、エネルギー需要が高い期間またはエネルギーバランスがマイナスになっている期間に 3-ヒドロキシ酪酸が増加することを実証した以前の研究の結果によって裏付けられています 37,55,56。 観察された傾向および循環代謝産物の存在量に対するさまざまな代謝経路の相対的な寄与は、本研究の実験計画では測定できないことに注意することが重要です。 他の代謝産物も、グルコース、クレアチン、フェニルアラニン、グルタミン酸、3-ヒドロキシイソ酪酸などの複数の代謝経路間の相互作用を反映している可能性があります。

W 子牛のクレアチン、クレアチンリン酸塩およびクレアチニンは、14 日目で NW 子牛と最も異なっていました。これらの代謝産物は、反芻動物のエネルギー代謝において、エネルギーを貯蔵およびリサイクルするために重要です。 クレアチンキナーゼ、クレアチン、およびクレアチニンの上昇は、過剰な筋肉の分解、身体活動やストレスの増加または不慣れな期間中の筋肉の損傷に関連しています45、46、47。 クレアチンは、身体活動中の脳組織と骨格筋の主要なエネルギー源の 1 つであり、酵素クレアチンキナーゼによってクレアチンリン酸に変換され、豊富なエネルギー源として蓄えられます47。 この反応は可逆的であるため、クレアチンリン酸はクレアチンに変換されてエネルギー (ATP) を生成し、その後クレアチンは不可逆反応でクレアチニンに変換されます。クレアチニンは、尿中に排泄される筋肉代謝の不活性最終生成物です 47,57。 このため、クレアチニンはタンパク質分解と体の筋肉量の指標としてよく使用され、負のエネルギーバランス下で体重が減少した分娩後の乳牛では通常、3-ヒドロキシ酪酸とNEFAの増加とグルコースの減少と同時に血中減少します58。 59. しかし、乳牛で観察されたこれらの変化は、3 つの代謝産物すべてが離乳後 14 日までに増加した本研究の離乳した子牛の結果とは対照的です。 本研究の W 子牛は、以前の研究と一致して、1 日目と 2 日目では離乳直後の身体活動の増加を示したが、7 日目と 14 日目では減少した。 したがって、14 日目までの W 子牛のクレアチンおよびクレアチニン量の増加は、身体活動、ストレスの行動指標、コルチゾール、または NEFA によって説明されないようです。 クレアチンの生成とクレアチンリン酸の貯蔵は、これらの代謝産物の「慢性的な」上昇につながる急性ストレスまたは激しい身体活動の期間後も継続する可能性があります。 しかし、この後者の仮説は、本研究のデータでは確認できず、エネルギーとタンパク質の代謝におけるそのような深刻かつ長期的な変化が、クレアチンとクレアチニンの慢性的な上昇を引き起こす初期の急性ストレスの結果であるかどうかを判断するには、さらなる研究が必要です。牛乳摂取の中止による代謝の変化。 いずれにせよ、W子牛は14日目まで異化状態にあったようで、クレアチン、クレアチニン、3-ヒドロキシ酪酸、グルコース、および一部のAAの相対濃度が高いことに反映されるように、タンパク質分解と脂肪分解の両方が起こっていました。

本研究では、北西部の子牛と比較して、西西部の子牛では、7 日目と 14 日目にアラントインが増加しました。 アラントインはプリン誘導体の 1 つであり、ルーメンからの微生物タンパク質の流れや OM 摂取によって増加し 60、尿素サイクルにも関与し、尿中に排泄されます 47。 さらに、アラントインは、牛と人間の両方における慢性酸化ストレス、病気、老化のバイオマーカーであることが示唆されています 61,62。 本研究では慢性ストレスは明らかではなく、NW 子牛と比較して W のアラントイン濃度が高いのは、牛乳摂取中止後の固形飼料摂取量の増加と第一胃微生物の活動の結果であると仮説が立てられています。 ただし、本研究では飼料摂取量は測定されていないため、この仮説を確認するにはさらなる研究が必要です。 同様に、W子牛のバリン、アラニン、スレオニン、ロイシン、リジン、フェニルアラニン、グルタミン酸が生後14日目まで持続的に増加した理由は、総タンパク質摂取量（乳と牧草の両方から）が測定されていないため、本研究では説明することが困難である。 。 タンパク質摂取量の指標として採血と同じ日に測定した糞便窒素濃度は、どの時点でも W 子牛と NW 子牛の間に差はなく、全体平均は W 子牛と NW 子牛の DM の 1.12 ± 0.033 % と 1.15 ± 0.032% でした。それぞれ（データは示されていない; P > 0.05）。 これは、下部消化管への総タンパク質の流れが西側子牛と北西側子牛の間で差がないことを意味している可能性があります。

血液中の代謝産物を測定する以前の研究は、本研究のように母牛の分離によるストレスを経験していない代替乳を与えられた子牛で実施されました。 さらに、乳製品 63 や肉用子牛 64 を対象としたこれまでの研究のほとんどでは、牛乳の摂取量が徐々に減少しており、これらの研究は動物が長距離を歩くなどのストレス行動を完全に表現できない小さな檻の中で行われてきました。 例えば、代用乳の給与を中止すると、血液中のグルコースやNEFAには影響が見られず64,65、グルコース、酢酸、プロピオン酸、酪酸は増加し、NEFAは減少しました63。 興味深いことに、上記のすべての研究で離乳後に 3-ヒドロキシ酪酸が増加しており、この代謝物が離乳した子牛の第一胃内で発酵された固形飼料の摂取量が増加した結果、第一胃上皮での酢酸塩と酪酸塩の変換に由来するという点で一致しています 63。 離乳時に囲いに入れられた牧草地を歩いている子牛を対象とした研究では、本研究と同様の結果が得られ、本研究とは異なり、グルコースとクレアチンキナーゼには影響がなかったものの、NEFAと3-ヒドロキシ酪酸の両方が離乳後に増加しました3。 後者の研究には、本研究のような対照NWグループがなかったことに注意することが重要です。 子牛に対する離乳の影響を検討した結果、循環ブドウ糖は研究全体で一貫性のない結果をもたらしたと結論付けられましたが、これらの不一致の原因は特定されていませんでした2。

本研究は、血液メタボロミクスが、ストレスや食事の変化から生じる複雑な相互作用から生じる代謝変化を調査し理解するための強力なプラットフォームであることを確認しました。 ハイスループットの 1H NMR と高度な統計の組み合わせは、大量の生物学的情報を生成する強力な組み合わせです。 メタボロミクスの分野は、複雑な代謝変化の理解を高めるのに重要な貢献をすることができます。 これにより、生産動物の管理、パフォーマンス、福祉を向上させる戦略の開発が促進される可能性があります。 例えば、離乳期の子牛用のサプリメントには、糖新生やストレス反応に必要なチロシンなどの代謝産物の前駆体を高濃度で配合することができます。 さらに、乳離れした子牛の栄養要件は、目標の量と種類のサプリメントを提供する新しい技術を使用して管理できる可能性があります66。 これらのアプローチは、ストレス反応とエネルギー消費を低下させることが知られている庭での離乳、フェンスラインへの接触、または 2 段階の離乳などの身体活動を減らす戦略と統合することもできます 8,9。

結論として、いくつかの主要な代謝産物は、ストレスと食事の変化による炭水化物、脂質、タンパク質代謝の顕著な変化を反映して、離乳後 14 日目までの子牛で劇的な変化を示しました。 ストレスによる代謝変化は短期間であり、離乳後 2 日目に最も顕著であったが、長期的な代謝変化は離乳後 14 日目まで観察された。 W子牛の脂質代謝における短期的な劇的な変化は、脂質の酸化を促進するメチル供与体としてのNEFAとベタインの急激な増加を反映していた。 代謝産物である 3-ヒドロキシ酪酸は、脂質代謝の短期および長期の両方の変化に関与しているようで、2 日目にピークに達し、離乳後 14 日目まで高い状態が維持されます。 脂質代謝の長期的な変化は、LDL/VLDL および不飽和脂質の濃度の低下によって示され、これは離乳後 14 日目に最も顕著であり、牛乳摂取の中止による食事の変化の結果である可能性があります。 炭水化物代謝に関連する最も重要な代謝変化は、14日目までのW子牛の血漿中のグルコース濃度の顕著な増加であり、これは糖新生の増加によるものである可能性がある。 さらに、7 日目と 14 日目に観察された酢酸塩の急激な増加は、第一胃内での固形飼料の発酵の増加を反映している可能性があり、これも W 子牛の 3-ヒドロキシ酪酸塩の高濃度の持続に寄与している可能性があります。 タンパク質代謝の変化は、14日目までのいくつかのAAおよびアラントインの増加を通じて証明されました。最後に、末梢筋肉および脳組織のエネルギー代謝における重大な長期変化は、循環クレアチン、クレアチンの相対濃度の大幅な増加を通じて反映されました。 14 日目までの W 子牛では、リン酸塩、クレアチニンが多く見られます。離乳後の子牛の長期代謝変化が代謝の永続的な変化なのか、それとも急性または慢性ストレスによる一時的な変化なのか、また代謝産物濃度が変化しているのかを確認するには、さらなる研究が必要です。離乳前の値に戻ります。

データは、責任著者への合理的な要求に応じて入手可能です。

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1H NMR に関する専門家のアドバイスをいただいた Ian Luck 博士と、動物の管理と世話について P. Lipscombe 氏、J. Lipscombe 氏、および S. Steedman 氏に感謝します。 また、図を作成していただいたオーガスト・イマズ博士、統計上のアドバイスをいただいたアラン・ライル氏、論文の初期バージョンについて建設的なコメントをいただいたアラン・ベル名誉教授にも感謝いたします。 JGSCはCNPq国境なき科学プログラム（ブラジル）、BCKはCAPES財団（ブラジル教育省）の支援を受け、ルチアーノ・A・ゴンザレス教授はマッコーイ記念信託およびナンシー・ローマ・ペク遺贈によって支援された。 この研究は、マイケル・J・ドッキオ教授へのナンシー・ローマ・ペク遺贈によって一部資金提供された。

この研究は、ナンシー・ローマ・ペック遺贈、マッコーイ記念信託、およびシドニー大学によって資金提供された。

シドニー農業大学および生命環境科学部、シドニー大学理学部、カムデン、ニューサウスウェールズ州、2570、オーストラリア

ルチアーノ・A・ゴンザレス、ジュリア・GS・カルヴァーリョ、ブルーノ・C・クインチトナー、マイケル・J・ドッキオ

サンパウロ大学獣医学部動物生殖学科、サンパウロ、SP、ブラジル

ジュリア GS カルヴァーリョ & ピエトロ S. バルセッリ

自然牧草生態学研究所 (LEPAN)、サンタマリア連邦大学、サンタマリア、RS、ブラジル

ブルーノ・C・クインチトナー

コリング医学研究所、ノーザン医科大学、シドニー大学、セント レナーズ、ニューサウスウェールズ州、2065、オーストラリア

アンソニー・C・ドナ

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JGSC: 概念化、データキュレーション、形式分析、調査、方法論、執筆 - 原案。 BCK、ACD、概念化、データキュレーション、形式分析、調査、方法論、執筆 - レビューと編集。 PSB: 概念化、執筆 - レビューと編集。 MJD: 概念化、方法論、資金調達、調査、方法論、プロジェクト管理、リソース、監督、執筆 - レビューと編集。 LAG、概念化、データキュレーション、形式分析、方法論、監督、執筆 - 原案。

ルチアーノ・A・ゴンザレスへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

ゴンザレス、LA、カルヴァーリョ、JGS、クインチトナー、BC 他血漿メタボロミクスにより、突然離乳した子牛の炭水化物、脂質、タンパク質の代謝に大きな変化が見られることが明らかになりました。 Sci Rep 13、8176 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-35383-2

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受信日: 2023 年 4 月 7 日

受理日: 2023 年 5 月 17 日

公開日: 2023 年 5 月 20 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35383-2

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