スウェーデンの野生反芻動物における寄生線虫ネマバイオーム群集

寄生虫とベクター 15 巻、記事番号: 341 (2022) この記事を引用

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野生動物の宿主は線虫の保菌者として機能し、家畜に伝染する可能性があります。 したがって、野生動物反芻動物のネマバイオーム構成を評価する研究は、スウェーデンの家畜ヒツジへの重要な線虫病原体の伝播の可能性を評価するのに非常に役立ちます。

まず、2019 年の狩猟シーズン中にスウェーデン中南部でノロジカ (n = 125)、ダマジカ (n = 106)、アカシカ (n = 18)、ムフロン (n = 13) から糞便サンプルが収集されました。糞便検査後、サンプルを培養して幼虫を採取し、続いて DNA を抽出しました。 第三に、すべてのサンプルはバーコード化され、PacBio プラットフォームで配列分析のために処理されました。 最後に、DADA2 を使用してバイオインフォマティクス配列分析を実行し、種の多様性と豊富さ、および異なる宿主間の相互作用を R で計算および分析しました。

線虫 ITS2 配列は、262 サンプル中 225 (86%) のサンプルで見つかりました。 合計 31 の分類群が特定され、そのうち 26 (86%) が種レベルに達しました。 これらはさまざまな組み合わせで見つかり、そのうち 24 件 (77%) がノロジカ、19 件 (61%) がダマジカ、20 件 (65%) がアカシカ、および 10 件 (32%) がムフロンで発生しました。 発見された種のうち 5 種は家畜に関連していることが知られています (Chabertia ovina、Haemonchus contortus、Oesophagostomum venulosum、Teladorsagia circumcincta、Trichostrongylus axei)。 しかし、本研究では、これらの種のほとんどの相対的な存在量と有病率は低かった。 最も顕著な例外は T. axei で、これはすべての野生動物宿主に比較的豊富に存在していました。 主に、Ostertagia leptospicularis や Spiculopteragia spp など、野生動物に特有の幅広い線虫が含まれます。 スウェーデンのアカシカ、ダマジカ、ムフロンで初めて発見された外来性線虫 Spiculopteragia houdemeri を含む、いくつかの線虫が確認されました。 ムフロンとすべてのシカ科動物 (n = 6) の間の共有種の数の差は、3 匹のシカ科動物すべての間 (n = 8) よりも小さかった。

この研究では、4 つの野生動物宿主における寄生性腸線虫の群集構造を調査し、同定された寄生虫種の大部分が野生動物に特有であることを発見しました。 また、これまで報告されていなかった新たな侵入の可能性のある種も発見されました。 この研究における野生動物宿主のネマバイオームを、同じ地理的地域の羊を対象とした以前の研究と比較した結果、水平感染の可能性は比較的低いと思われると結論付けました。 それでも、狩猟肉と羊の間の線虫の交差感染を完全に無視することはできません。

家畜に対する経済的影響の可能性のため、野生動物の蠕虫に対する関心が近年高まっています。 まず、いくつかの野生の有蹄動物が一般的な寄生虫の保有者として機能し、それが家畜に交差感染する可能性があることが確立されています[1、2、3]。 第二に、気候変動が野生動物と家畜の間の寄生虫の伝播生物学に影響を与える可能性があることが示唆されています。 たとえば、ノロジカ (Capreolus capreolus) の場合、個体数の拡大と生息地の変化により宿主の範囲が変化しました [4]。 放牧期はより暖かく、より雨が多い傾向にあるため、最終的には、異なる宿主種が相互作用するときに家畜の病原体への曝露が増加する可能性があります[5]。 第三に、感染曝露の変化は、離れた地域間で感染した狩猟動物の取引が増加した結果である可能性もあります。 いくつかの例としては、最近ヨーロッパに導入された Ashworthius Sidemi と Spiculopteragia Houdemeri があります。 両種はアジア起源の侵略的寄生虫とみなされ、20世紀後半から中央ヨーロッパに蔓延している[6、7、8、9]。

小型反芻動物における線虫感染症に関しては、明らかな理由から主に Haemonchus contortus、Teladorsagia circumcincta、Trichostrongylus axei などの自然発生病原体に注目が集まっています [3、10]。 3 種はすべて家畜ヒツジにおける重要な第四胃線虫線虫であり、特に H. contortus と T. axei はヨーロッパ全土のノロジカ (Capreolus capreolus) からさまざまな組み合わせで記録されている [11,12,13,14,15,16] 、17、18、19、20] だけでなく、ポーランドのダマジカ (Dama dama) [18]、イタリアとポーランドのアカシカ (Cervus elaphus) にも存在します [18、21]。 H. contortus と T. circumcincta [22] はどちらも現在、スウェーデン中南部の羊の群れで一般的に見られますが、61 の商業動物から収集されたサンプルに対して行われたネマバイオーム研究で示されているように、T. axei の発生はより散発的です。農場[23]。 ヒツジにおいて唯一最も重要な病原性寄生虫であると世界的に考えられている H. contortus [22] は、過去にはスウェーデンのノロジカではまれでしたが、この寄生虫が野生動物の宿主から羊に伝染する可能性があることが数十年にわたって示唆されてきました。 24]。 しかし、今日この種がノロジカにどの程度蔓延しているのか、また他の野生宿主を介した伝播が起こるのかどうかは不明です。 しかし、実験的証拠[25]や、高山地域のさまざまな宿主から収集された標本の遺伝的研究は、野生と家畜の反芻動物の間で伝染が実際に起こることを示唆している[26]。 同様に、T. axei は同所性宿主種間で高い遺伝子流動を示す国際的なジェネラリストであることが示されています [27]。 これらの線虫に加えて、Chabertia ovina および Oesophagostomum venulosum も野生の反芻動物と羊の間で伝染する可能性があります [3]。 しかし、一般的な知識によれば、これら 2 つの種は珍しいものであり、スウェーデンでは羊にとって主要な病原体とは考えられていません。

野生の反芻動物が家畜と一部の線虫を共有していることは十分に文書化されているため、理論的には、駆虫抵抗性を決定する対立遺伝子や感受性の遺伝子型を保有する線虫も伝染させる可能性がある[28]。 主に H. contortus および T. circumcincta に関連するヨーロッパの反芻動物の家畜線虫における駆虫抵抗性のレベルの出現に伴い [29]、抵抗性株の媒介者としての野生生物の役割が提案されている。 一方、Chintoan-Uta et al。 [17]ブラウンらは、ノロジカは家畜から耐性菌H. contortusを獲得する可能性があると結論付けた。 [30] は、野生動物の宿主が未治療の避難源として機能することにより、蔓延の遅延に等しく貢献する可能性があると示唆した。 このことは、H. contortus がヒツジとノロジカに共通しているが、後者ではホモ接合性の感受性遺伝子型がより一般的であるというハンガリーの研究でさらに実証されました [19]。 したがって、たとえ家畜と野生動物の間の耐性H. contortus遺伝子型の伝播が共有牧草地で実験的に確認されたとしても、それが農場で起こるとは保証されない[25]。

まず、異なる宿主種間での寄生虫の相互感染の可能性は、同じ資源を共有する共有牧草地における感染動物の密度に影響されます[3、31]。 一部の寄生虫は近縁の宿主に感染することが知られていますが、同時に、異なる宿主種では感受性や寄生虫の繁殖力に違いがある可能性があることも十分に確立されています。 例えば、ある実験研究によると、ヨーロッパのムフロンは、感染後11週間で糞便1グラム当たり20,000個を超えるH.コントルタスの卵を排出していた[25]。 さらに、寄生虫の自由生活段階の発達および生存能力は、感染プロセスの鍵となるため、重要な役割を果たします。 例えば、牛の線虫の自由生活段階の生態に関するカナダの調査では、放牧期の終わりに多数の幼虫が糞便の中に残っていたが、短期間の降雨が移動に重要な影響を及ぼしたことが明らかになった。牧草地の幼虫 [32]。 その結果、牧草地に生息する寄生虫は季節性の感染パターンを示し、気候変動と土地利用の両方に非常に敏感です。 他の生物と同様に、線虫は局所環境の条件に適応します[33]。 したがって、さまざまな種の自由生活段階の感受性は、環境内の温度と湿度レベルに応じてそれぞれ異なる進化を遂げてきました。 例えば、Ostertagia spp.などのいくつかの種の感染性幼虫は、 と Trichostrongylus spp. は一般に寒さに適応しており、最初の 1 年に摂取しなければ牧草地で越冬することができます [34]。一方、H. contortus などの他の種は、たとえこれが特別なものであっても、-3 ℃ 未満の温度に敏感であるようです。種は北極地域全体に広がっている[35]。 つまり、野生動物と家畜宿主の間での線虫の相互伝播のリスクは、さまざまな寄生虫種が採用する越冬戦略にも影響を受ける可能性があります。

伝統的に、野生動物の線虫群集は、剖検で回収された成虫の雄の線虫の形態学的基準によって特定されてきました。 分子技術の進歩により、現在では糞便サンプルを利用して存在する属および/または種を決定することが可能になっています。 最近、家畜反芻動物で最も豊富で多様な寄生虫である、考えられるすべての線虫を同時に同定する方法が、内部転写されたスペーサー 2 rDNA アンプリコンの次世代配列決定に基づいて開発されました [36]。 この技術は、フランスのノロジカ [15] や米国の他の野生有蹄動物 [28] のサンプルを調査するためにも利用されています。 このアプローチの最も重要な利点は、感度と特異性の向上、寄生線虫群集全体の公平な定量化、および潜在的な種に関連する問題の軽減です[36]。

現在、寄生性線虫に焦点を当てた全国的かつ系統的な研究はほとんど行われていないため、スウェーデンの野生動物に発生する蠕虫に関する知識は限られています。 私たちの知る限り、発表された研究は 2 つだけです。1 つ目は、1960 年代後半に実施されたノロジカ (n = 306) とヘラジカ (Alces alces) (n = 19) の摂取物から取り出された成虫に基づいています。 24]、2番目は死んだヘラジカまたは衰弱したヘラジカのサンプルに基づいています(n = 50) [37]。 今回の調査は、スウェーデンのほとんどの羊牧場が位置する地域のシカ種、つまりノロジカ、ダマジカ、そしてある程度はアカシカやムフロン（Ovis aries musimon）に焦点を当てている。 3 匹のシカ科動物はスウェーデンではかなり一般的ですが、ムフロンはまれです [38]。 このうち、ノロジカはスウェーデンで最も多く生息しており、サンプリング地域全体で 100 年以上にわたって生息しています。 ゴットランド島で唯一のシカ科動物です。 過去 30 年間、国の南部ではダマジカとアカシカが本土で増加しました (www.viltdata.se、スウェーデン狩猟者協会主催、2022 年)。 ムフロンはスウェーデンでは外来種とみなされており、2005年に行われた最新の個体数推定では、個体数は約1000頭と推定されている[38、39]。 本研究では、野生動物と家畜反芻動物の間で寄生虫が交換されるリスクをよりよく理解し、評価するためのベースラインデータを提供するために、前記野生動物宿主における線虫ネマバイオーム群集を調査した。

2019年8月から11月の主要な狩猟シーズンに先立ち、狩猟者らは狩猟報道機関を通じてこの研究について知らされ、参加するよう求められた。 参加に同意した者には、研究室に送る前に、アカシカ、ダマジカ、ノロジカ、ムフロンの直腸から糞便サンプルを採取し、密閉したジップロックの袋に入れて保存（+4℃）する方法を指導されました。 サンプルは郵送または直接提出により当社の研究室に受け取られた後、さらなる処理の前に + 4 ℃ で短期間保管されました。 Vidilab AB からの追加の 29 頭のノロジカのサンプルと合わせて、合計 18 頭のアカシカの糞便サンプル、106 頭のダマジカのサンプル、125 頭のノロジカのサンプル、および 13 頭のムフロンのサンプルを受け取りました。 動物が（狩猟され）サンプリングされた場所は、スウェーデン南部全域に分布していました（図 1）。 糞便卵数は、修正された McMaster プロトコルを使用して分析されました [40]。 残りの糞便を使用して共生培養を設定し、以前に記載されているように倒立ペトリ皿法を使用して L3 幼虫を収集しました [41]。 これらのサンプルに加えて、商業診断研究所から L3 共培養物も受け取りました。 メーカーのプロトコールに従って、Nucleospin DNA組織キット(Macherey-Nagel)を使用して幼虫から全DNAを抽出した。

スウェーデン南部のサンプリング場所の地図。 ゴットランド島（図の左側）にはノロジカのみが生息しています

各サンプルは、ユニバーサル線虫内部転写スペーサー領域 2 (ITS2) リボソーム DNA プライマー (NC1-NC2) を使用して増幅され、シーケンス用にプールする前に固有の 8 bp バーコードと結合されました。 つまり、50 μl の PCR 反応を 2 回実行し、AMPure XL 磁気ビーズを使用してクリーンアップしました。 クリーンアップされた PCR 産物は、スウェーデン、ウプサラの SciLifeLab にある SMRT セル V3 RSII を使用した Pacific Biosciences シーケンス プラットフォームでシーケンスする前に、等量プールされました。 詳細については、Halvarsson と Höglund [23] を参照してください。

各シーケンス プールは、lima v2.4 (https://github.com/PacificBiosciences/barcoding) (lima reads.fq.gz barcodes.fasta demux.fastq -hifi-prefix SYMMETRICS) を使用して逆多重化されました。 ここでは、R の DADA2 [42] パッケージを使用して、配列データセットからアンプリコン配列バリアント (ASV) を推測しました。 まず、未解決のヌクレオチドを含むリードを削除しました (maxN = 0)。 次に、両端のプライマーをアンプリコン配列から削除しました (dada2::removePrimers)。 第三に、予想よりも高いエラー数 (maxEE = 2) と 200 bp 未満のシーケンスが削除され、シーケンシングエラー率 (learnErrors、errorEstimationFunction = PacBioErrfun) が推定され、データセットの修正に使用されました。 4 番目に、サンプル データの複製が解除されました (derepFastq)。 5 番目に、複製が解除されたデータセットを入力データ (dada) として使用してサンプルが推論されました。 最後に、キメラを削除し [removeBimeraDenovo(method = 'consensus')]、 https://www.nemabiome.ca/its2 からダウンロードした分類学的線虫 ITS2 データベース (v1.2.0) を使用して ASV の分類学的割り当て (assignTaxonomy) を実行しました。 -database.html [36、43]。 汚染を考慮するために、各 ASV のシングルトンリード、およびサンプルごとにリード数が全体の 0.5% 未満の ASV がフィルタリングされて除外されました [44]。 さらに、リード数が 200 未満のサンプルはさらなる分析から除外されました [23]。 GeneBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) で入手可能な Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) を使用して、正しい種の割り当てを検証し、未解決の ASV の欠落している分類学的データをアイデンティティに基づいて埋めました。 。 寄生性線虫以外の生物への ASV の割り当ては削除されました。 ASV への種の割り当ては、同一性パーセンテージが参照配列の 98.5% 以上である場合にのみ考慮されました。 同じ分類学的同一性（すなわち、参照データベースとの整列配列類似性による種）として同定されたすべてのASVリードをマージした。 この種のクラスタリングは、数百または数千の ASV を少数の種に縮小し、ネマバイオームの解析における重要なステップです。 同じ種に属することが判明した ASV が多いほど、その種は遺伝的に多様性が高くなります。 たとえば、さまざまな ASV を Trichostrongylus sp. にグループ化しました。 A および Trichostrongylus sp. B は、BLAST 検索における配列類似性と最もよく一致する配列に基づいています。 最後に、最終的な種のデータセットが統計分析に使用されました。

すべての統計分析は R v4.2.0 (2022 年 4 月 22 日にリリース) で実行されました [45]。 種の豊富さはすべての種を合計することで計算され、相対頻度に基づいて読み取り数を標準化した後、R パッケージ vegan v2.5.7 を使用して逆シンプソンおよびシャノンウィナー アルファ多様性指数が計算されました。 ベン図の作成には VennDiagram v1.7.1 パッケージが使用されましたが、UpSet プロットは ComplexUpset v1.3.3 パッケージで作成され、n = 3 でホストのカットオフが実装され、図 5 に結合されました。プロットは ggplot v3 を使用して視覚化されました。 .3.5。

DADA2 によるフィルタリングと ASV クラスタリングの後、13/18 頭のアカシカ、86/106 頭のダマジカ、114/125 頭のノロジカ、および 12/13 ムフロンのサンプルが保持されました。 合計 884,113 のリードがサンプルから得られました (平均 3929、サンプルあたり 202 ～ 7931 のリード)。 ASV クラスタリングにより、31 種の線虫を表す 916 個の ASV が得られ、そのうち 26 種 (84%) が種レベルで同定されました。 最も多様性が高いのはノロジカ (n = 24) で、次いでダマジカ (n = 19)、アカシカ (n = 20)、ムフロン (n = 10) であり、種の数は宿主間で大きく異なりました ( GLM種の豊富さ、F = 4.44、df = 3、P = 0.0047)。 さらに、2 つのアルファ多様性指数によって測定された、さまざまな宿主からのサンプルの平均種多様性は、グループ間で大きく異なりました。 ムフロンの多様性値は最も低く、アカシカは最も高かった (GLMInverseSimpsons、F = 6.88、df = 3、P = < 0.0001; GLMShannon-Wiener、F = 5.93、df = 3、P = < 0.0001) (図 2) 。 同定された種の中では、Chabertia ovina、Oesophagostomum venulosum、Ostertagia leptospicularis、Ostertagia sp.、Spiculopteragia asymmmetrica、Spiculopteragia boehmi、Spiculopteragia houdemeri、Trichostrongylus axei、および Trichostrongylus sp.の 9 種が優勢であることが確認されました。 B. これら 9 種を合わせて 837,464 (94.7%) のリードがあり、627 (68%) の ASV が形成されました (表 1 および図 3)。

4 つの宿主種の寄生虫の多様性プロット。 4 つの宿主種の種の豊富さ (A)、最も多くの寄生種が個々のアカシカで見つかりました。 逆シンプソンの多様性指数 (B) とシャノン・ウィナー指数 H' (C) は、宿主種のアルファ多様性の 2 つの異なる測定値です。 バイオリンプロット内の箱ひげ図には中央値が表示されます

種組成の概要の棒グラフ。 Trichostrongylus axei がすべての宿主に共通の寄生虫である 4 つの宿主種のネマバイオーム組成の平均頻度

対照的に、ムフロンは糞便 1 グラム (EPG) あたりの線虫卵の数が最も多く (平均 EPG: 517、SD = 392)、次いでノロジカ (平均 EPG: 152、SD = 237)、ダマジカ (平均 EPG: 68) でした。 、SD = 108）と最も少ないアカシカ（平均EPG：7、SD = 19）（図4A）。 寄生虫種の豊富さは EPG の影響を受けず (GLM: t = 28.74、df = 187、P = 0.086)、共生培養のために処理された糞便サンプルの量も影響されませんでした (GLM: t = 10.72、df = 54、P = 0.54) (図４Ｂ、Ｃ）。

EPG と糞便サンプルが種の豊富さに及ぼす影響。 ほとんどのサンプルの EPG 数は低かったが、ムフロンの EPG カウントは平均して最も高かった (A)。 EPG が高いほど種の豊富さは増加しましたが (B)、共生栽培用の糞便サンプルは種の豊富さには影響しませんでした (C)

特定の種に感染した宿主の数は宿主種によって異なります。 ノロジカで最も蔓延している 3 種は、O. leptospicularis (82%)、S. boehmi (62%)、および Trichostrongylus sp. でした。 B (50%); ダマジカ：Ostertagia sp. （49％）、S.アシンメトリカ（67％）およびT.アクセイ（42％）。 アカシカでは: O. leptospicularis (33%)、S. asymmmetrica (67%)、および T. axei (42%)。 ムフロン：O. leptospicularis (38%)、Teladorsagia circumcincta (62%)、および T. axei (92%)。 各宿主種におけるすべての寄生虫種の出現と相対的な存在量の詳細については、表 1 を参照してください。

NCBI BLAST からの類似性に基づいて、同じ種に属する異なる ASV を結合した (つまり、種のクラスタリングを実行した) 後、31 の固有の分類群が見つかりました。 6 種 (19%) がすべての宿主種に共通であった: Oesophagostomum venulosum (シカ科動物では比較的相対的に少ない、2 ～ 9%、ムフロンではわずか、< 1%)、O. leptospicularis (すべての宿主で低から中程度、1.5 ～ 30%)、Ostertagia sp. (ノロジカとムフロンでは有意ではない、< 1%、ダマジカとアカシカでは低レベル、8 および 9%)、S. ametrica (ノロジカとムフロンではわずか、< 1%、ダマジカとアカシカでは中程度、24)および48％）、Teladorsagia circumcincta（すべての宿主でわずか、1％未満）およびT. axei（ムフロンで高レベル、84％、他の宿主でも低レベルから中等度、10～26％）（図5）。 Trichostrongylus axei は、ASV の数に基づいて最も遺伝的に多様な種の 1 つでした。 また、最も一般的な 12 種類の ASV がすべての宿主種にわたって見つかったため、汎用性があるようです。

ホストの特異性とコミュニティの構成。 左上隅のベン図は、4 つの宿主種に共通する固有の寄生虫種の数を示しています。 6 種がすべての宿主に共通でした (Oesophagostomum. venulosum、O. leptospicularis、Ostertagia sp.、Spiculopteragia asymmmetrica、Teladorsagia circumcincta、および Trichostrongylus axei)。 アプセットダイアグラムは、少なくとも 3 つの宿主で見つかる可能性のある寄生虫の組み合わせを示しています。最も一般的な組み合わせ (Spiculopteragia asymmmetrica と Ostertagia sp.) は 13 匹のダマジカ宿主で見つかりました。 最も一般的に確認されている寄生虫であるオステルタギア・レプトスピキュラリスは、136 の宿主で発見されました。

シカ科動物では、13 (42%) の寄生虫種が少なくとも 2 つの宿主種に共通していましたが、これらはムフロンには見つかりませんでした。 これらは、Chabertia ovina (ダマジカでは低罹患率、ノロジカでは中程度の罹患率、1% と 26%)、Coronocyclus cancertus (ノロジカとダマジカでは低い罹患率、1% と 2%)、Cyatohostomum catinatum (ノロジカでの罹患率は低い) でした。ノコシカとアカシカ、4% と 6%)、Cylicocyclus nassatus (ノコシカとダマジカで低い有病率、6% と 1%、アカシカで中程度の有病率、17%)、Cylicostephanus calicatus (すべてで有病率が低い、1 ～ 6) ％）、Cylicostephanus longibursatus（ダマジカとノロジカでの罹患率が低い、1％と4％）、Cylicostephanus minutus（ノロジカとアカシカでの罹患率が低い、2％と6％）、Dictyocaulus sp. (全体で低から中程度の有病率、2 ～ 11%)、Haemonchus contortus (全体で低から中程度の有病率、2 ～ 17%)、Oesophagostomum dentatum (全体で低有病率、2 ～ 11%)、S. boehmi (ノロジカでの有病率は 62% と高いが、ダマジカとアカシカでは低から中程度で、8% と 22%)、Trichostrongylus sp. A (全体での有病率は低く、2 ～ 6%) および Trichostrongylus sp. B (ノロジカでは有病率が高く、50%、ダマジカとアカシカでは低から中等度、4～11%) (表 1)。

さらに、1 つの宿主種でのみ見つかった 10 種 (32%) を特定しました。そのうち 2 種はムフロン (Copereria oncophora と Muellerius capillaris)、3 種はアカシカ (Cylicostephanus goldi、Elaphostrongylus rangiferi、Strongylus vulgaris)、5 種はアカシカでした。ノロジカ (Cylicocyclus ashworthi、Cylicocyclus leptostomus、Mazamastrongylus dagestanica、Ostertagia ostertagi、Trichostrongylus colubriformis) が生息していましたが、ダマジカには固有の種がありませんでした。 (図5)。 しかし、これらのほとんどはまれであり、M. ダゲスタニカを除いて、少数の宿主個体でのみ発見されました。M. ダゲスタニカは、125 匹中 11 匹 (9%) もの割合で発見され、平均相対存在量は 14% (0.1 人の間で変動) でした。および98%）ノロジカに含まれています。

野生の反芻動物は特定の線虫の宿主として機能する可能性があるため、国内の放牧家畜における線虫群集の空間分布を形成する上で重要な役割を果たしている可能性があります。 野生宿主における寄生虫の生物学的多様性に関する知識は生物学的に一般的な興味深いものであるという事実に加え、これは獣医学の観点から野生有蹄動物のネマバイオーム構成を研究することを正当化する。 羊における線虫線虫の保有者として機能する特定の野生生物の役割に焦点を当てた現在の研究では、31種を特定し、そのうち24種（77％）がノロジカ、19種（61％）がダマジカ、20種（65％）が特定された。ネマバイオーム配列決定を使用して、線虫の幼虫を含む培養糞便サンプルに対して実行された、アカシカで )、ムフロンで 10 (32%)。 特定された種のうち、わずか 15 種 (48%) が、取得されたリードの > 99% を占めていました。 最も一般的な 3 種は、O. leptospicularis、S. boehmi、および Trichostrongylus sp. でした。 ノロジカのB。 S. アシンメトリカ、Ostertagia sp. ダマジカの T. axei。 アカシカでは O. leptospicularis、S. asymmetrica、T. axei、ムフロンでは O. leptospicularis、T. circumcincta、T. axei。 これらを結合すると、読み取り総数の 85% を占めます。 特に興味深いのは、T. axei に加えて、最近家畜の羊で報告された 4 種も同じ地理的地域で同定したことです [23、44]。 これらのうち、T. axei のみが野生動物宿主内で低レベルから高レベルで検出されました。 対照的に、ヒツジに発生することが知られている種（C. ovina、H. contortus、O. venulosum、および T. circumcincta）の相対存在量推定値は、一部の野生動物宿主ではわずかであるか低い、および/または存在しません。 これらの結果を総合すると、調査した有蹄動物が家畜が放牧される牧草地における寄生性線虫の蔓延に関与している可能性があることを示唆している。 しかし、家畜化された羊と研究対象の野生動物宿主のネマバイオームプロファイルは非常に異なって見えるため、このようなことが起こる可能性は低いと考えられます。 それでも、例えば H. contortus の交差感染のリスクは無視できません。

Poulin と Mouillot [46] によって指摘されているように、蠕虫寄生虫の宿主特異性は、宿主種間の分類学的差異が減少するにつれて増加します。 私たちの研究で特定された 31 種のうち、21 種 (68%) は複数の種類の宿主に発生しましたが、10 種 (32%) は 1 つの宿主種のみに発生しました。 しかし、4 つの野生動物宿主すべてにおいて、変動する相対存在量で見つかったのは 6 種 (O. venulosum、O. leptospicularis、Ostertagia sp.、S. asymmmetrica、T. circumcincta、T. axei) のみでした。 これは Wyrobisz-Papiewska らの意見と一致しています。 [47]らは、形態学的分子的アプローチを組み合わせたアプローチに基づいて、例えば O. leptospicularis がシカ科動物およびウシ科動物の宿主において一般的であると結論付けた。 同様に、T. axei はジェネラリストであることが示されています [27]。 一方で、他の 6 種 (C. calicatus、H. contortus、O. dentatum、S. asymmmetrica、Trichostrongylus sp. B) も確認されましたが、これらはすべてのシカ科動物にのみ共有されており、ムフロンには共有されていませんでした。 したがって、我々のデータによれば、シカ科動物間で共有される種の数は、ムフロン種と比較して多かった。 これは、特殊な蠕虫が 2 つの密接に関連した反芻動物種で発生する傾向があると述べた [3] と一致しています。 O. leptospicularis と T. axei は、研究に含まれたすべての宿主種の中で最も頻繁に代表される種の 1 つでしたが、シカ科動物は、Spiculopteragia 属内の線虫や 2 種類の未確認の Trichostrongylus など、野生動物に特有のよく知られた線虫により頻繁に感染していました。種対照的に、少数のムフロンは主に、オエソファゴストマム属、T. circumcincta、T axei などのヒツジと共通の線虫に感染していましたが、S. asymmmetrica、S. houdemeri、Ostertagia sp. などの他の線虫も感染していました。 鹿とも共有しました。

驚くべきことに、ムフロンは、本研究のシカ科動物とは異なり、主にスウェーデンで捕獲された幼虫として宿主の体内で冬を越す寄生虫であるH. contortusに感染していなかった[48]。 ムフロンがシカ科動物よりも H. contortus に対して感受性が高いことはよく知られている [25]。この宿主のサンプル サイズが限られていたため (n = 12)、この種をデータセットで特定できなかった可能性があります。 それにもかかわらず、この観察は Balicka-Ramisz らの観察と一致しています。 [49]、ポーランド全土で実施された年次調査でもムフロンから H. contortus は見つかりませんでした。 一方、イタリアの高山地域 [14] とスペイン [50] の両方のムフロンで流行していました。 反対に、私たちは、卵、ダマジカ、アカシカから H. contortus を発見しました。 この所見はいくつかの研究と一致している[16、18、20、21、51]が、調査された動物の20%から半数以上がH. contortusに感染していたという他の研究では一致していない[11、13、17、19]。 H. contortus の相対的な存在量はすべての宿主において有意ではありませんでしたが、アカシカにおける有病率はノコシカやダマジカとは対照的に高いことがわかりました。 さらに、本研究と一致して、シカ科動物では一般に H. contortus が T. axei よりもまれであるようです [16、20、21、52]。 興味深いことに、本研究では、T. axei が最も蔓延している寄生虫の 1 つであり、ノロジカの 38%、ダマジカの 42%、アカシカの 50%、ムフロンの 92% が感染していることがわかりました。 これは、Bolukbas らの意見と一致しています。 (2012) および Chintoan-Uta ら。 [17]、彼はノロジカにおける T. axei の推定有病率を 67 ～ 80% と報告しました。 ここで示した T. axei の有病率の数値 (38%) は、スウェーデンで以前に報告されたノロジカの有病率 (11%) [24] や他のヨーロッパ諸国 [16、18、20] よりも高いです。 また、アカシカとダマジカに関する我々の現在の数値（それぞれ 50% と 42%）は、他の研究の数値（1 ～ 20%）よりも高くなっています [14、17、18、21、50、53]。 いずれにせよ、我々の調査対象となった野生宿主が宿主として機能しているのであれば、H. contortus とは異なり、T. axei が同じ地域の家畜羊では珍しいことは矛盾しているように思えます。 私たちの研究では、ムフロンでは T. axei が優勢な種であるのに対し、宿主であるシカではそれほど蔓延していないことがわかりました。 リード数が最も高い 12 のハプロタイプ (ASV) がすべての宿主種で見つかり、T. axei が真のジェネラリストであるという見解を裏付けています。 しかし、Walker と Morgan [1] が示唆しているように、野生動物と家畜の間での線虫の実際の伝播は、同じ寄生虫種が複数の宿主に存在するという事実だけでは保証されません。 したがって、野生生物の実際の役割についてより最終的な結論を下す前に、Archie と Ezenwa の研究と同様の個体群研究 [27] が必要である。この研究では、いくつかの宿主種からの同じ寄生虫の異なる分離株の ITS2 以外の遺伝子領域における遺伝的変異も調べた。ホストを描画できます。

異なる宿主種における寄生虫を適切に同定することは、当然ながら、それらの間の相互感染の可能性を理解するための基礎となります。 トリコストロンギリ上科のメンバーなど、一見すると宿主の種または科に特異的であるように見えるメンバーもいますが、他のメンバーはさまざまな宿主種で観察されます。 Suarez と Cabaret [57] が示唆しているように、各要因の影響を簡単に評価できない場合でも、宿主の特異性と環境の両方が種組成の形成に重要な役割を果たしています。 形態学的特徴のみに基づいて密接に関連した種を区別することは時々困難であるため、通常は分子的方法による確認が必要である[54]。 これは、Trichostrongylidae 科のいくつかのメンバーにモルフが存在するという強力な証拠があるためです。 例えば、広範囲の野生動物や家畜宿主で記載されている T. circumcincta、Teladorsagia trifurcata、および Teladorsagia davtiani が単一種であるという遺伝的証拠があります [55]。 遺伝データはまた、S. asymmetica と Spiculopteragia quadrispiculata が単一種の形態学的に異なる変異体を構成していることを示唆しています [56]。 同様に、O. コルキダエと O. レプトスピキュラリスは単一の種のペアを表すことが示唆されています [57]。 しかし、野生動物の系統がウシ科の系統とは異なることが実験的に証明されているため、O. レプトスピキュラリスが謎の種であることを示唆する強力な証拠もある[47]。 さらに、例えば Haemonchus spp. 間など、密接に関連した種間の交雑が時々発生します。 熱帯地方の共同放牧条件下で。 総合すると、これらの現象 (多型性および潜在的な種、交雑) は、トリコストロンギリス線虫の間で一般的であると思われます。 これは、私たちの研究で特定された種が複数の ASV で表されていることから示されています (表 1 を参照)。 このことは、我々の現在の発見と、ヨーロッパのシカ科動物における線虫の種組成に関する以前の有病率研究の結果との比較を複雑にする。 これは、Beaumelle らによる研究を除いて、ほとんどのヨーロッパの研究が伝統的な方法に基づいているためです。 [15]、ノロジカのサンプルにおける種の同定は、代わりに同様のネマバイオーム分析アプローチに基づいていました。

私たちの ITS2 ネマバイオーム データセットをフランスのノロジカのデータセットと比較したところ [59]、結果は主に相互に支持されていましたが、いくつかの点で異なっていました。 たとえば、C. ovina、O. leptospiicularis、O. venulosum、T. axei は、両方のノロジカ研究で最も蔓延していたものの 1 つでした。 さらに、両方の研究において、H. contortus または T. circumcincta に感染した動物は一部のみでした。 ただし、1 つの違いは、S. boehmi (有病率 = 62%、リードの 25%) と S. asymmmetrica (有病率 = 12%、リードの 8%) の両方を同定したが、これらの種は、フランス語の勉強。 しかし、S. boehmi はオランダ [16] とポーランド [18] ではノロジカのよく知られた寄生虫であり、これは我々の発見と一致しています。 また、S. boehmi がダマジカとアカシカの両方に発生していることもわかりました。 我々の研究のように、S. asymmmetrica は通常、これら 2 つのシカ科動物に関連するこの属の種ですが、ノロジカからも報告されています [18、53、60、61]。 実際、私たちの分析によると、S. asymmytrica はダマジカの読み取りの 50%、アカシカの読み取りの 28% で表されていました。 さらに、これらのホストのリードの 4% ～ 5% が S. houdemeri と一致しました。 この寄生虫は主に極東の広範囲の在来シカ科動物で知られているが、日本のニホンジカ (Cervus nippon) から回収された標本からの形態学的および分子的ツールの両方によって非常に詳細に記載されている [62]。 最近、オーストリアとドイツ両国のニホンジカからの症例報告により、S. houdemeri は侵入性寄生虫として記載されていますが、チェコ共和国では野生のノロジカ、ダマジカ、アカシカの間で定着していることも知られています [9] ]。

Beaumelleらによる研究と比較したもう1つの違い。 [15] は、B. trigonocephalum を特定しなかったことです。 しかし、フランスでは、この種は 1 つの地域で比較的少量しか発見されませんでした。 さらに、Beaumelle らとは異なります。 [15]、我々は、S. houdemeri と同様にコーカサス地方に起源を持つ Mazamastrongylus dagestanica を検出しました。 Mazamastrongylus dagestanica は以前は Spiculopteragia alcis として知られ、当時はノロジカやヘラジカの典型的な寄生虫と考えられていましたが、元の形態学的記述は羊の標本で行われました [63]。 私たちの研究では、この種はノロジカのみで見つかりました (9%)。 興味深いことに、1970年代の古いスウェーデンの研究では、S. alcisの有病率はノロジカで38%、ヘラジカでは100%でした[24]。 さらに、通常は馬に見られる線虫の9種を特定しました。 ただし、データを結合すると、これらの分類群は読み取り総数の 1.4% にすぎません。 したがって、これは実験室の汚染またはシーケンスアーチファクトのいずれかが原因である可能性があります。

Beaumelleらによって述べられているように、野生動物線虫のサンプリングと客観的な同定のための費用対効果の高い代替方法はほとんどありません。 [15]、ネマバイオームアプローチの欠点は、野生動物の線虫の配列データが欠落しているか、一般的なデータベースで非常に過小評価されていることです。 これは、さまざまな種が 1 ～ 173 個の ASV で表される我々の分析でも明らかです (表 1)。 私たちの研究で最も多くのASVを有する2種は、O. leptospicularisとT. axeiであり、O. ostertagiとCooperia sp.はO. leptospicularisとT. axeiです。 それぞれ 2 つと 1 つの ASV だけで実行されます。 さらに、Beaumelle らと同様に、 [15]、一部の ASV については種を特定できませんでした。 それでも、私たちの研究では、31 個の ASV クラスターのうち 26 個 (84%) もの多くが種レベルに割り当てられました。 それにもかかわらず、私たちがノロジカで発見した最も一般的な種の 1 つである Trichostrongylus sp. の分類は、 B は完全には明らかではないため、さらなる調査が必要です。 いずれにしても、ネマバイオーム配列決定は、たとえこの方法に欠点がないわけではないとしても、野生動物の線虫の多様性と豊かさを客観的に評価するための貴重な方法です。 たとえば、公開データベースに参照配列が欠落しているため、種の適切な同定ができない場合がありました（つまり、Dictyocaulus、Cooperia、Ostertagia 属にそれぞれ 1 つのメンバー、Trichostrongylus 属に 2 つ）。

私たちの研究のもう一つの限界は、ムフロン (n = 13) とアカシカ (n = 18) の両方で、調べた宿主あたりのサンプル数が大きく異なり、ダマジカ (n = 106) やノロジカほどよく研究されていないことです ( n = 125)。 したがって、一部の宿主種からのサンプル数が少ないため、ムフロンの H. contortus などのいくつかの種を見逃した可能性を排除できません。 線虫感染に対する感受性は、同じ宿主種間で、さらには同じ宿主種内でも異なることもよく知られています。 たとえば、フランスでは、成人男性は少年や成人女性と比較して重度の感染症を患っていた[64]。 同様に、スペイン中部のアカシカでは、第四胃寄生の発生と強度の両方が、高齢の動物、特に雄でより高かった[65]。 しかし、イベリア半島北西部の狩猟期におけるノロジカの線虫量に影響を与えるのは性別のみであり、オスの線虫量がより多かった[20]。 対照的に、ダマジカの子牛は、一歳の子よりも寄生虫の数が有意に多かったものの、雌雄間に差はありませんでした[60]。 同様に、フランスでは、ノロジカの寄生虫群集のアルファ多様性は雌雄間で差がありませんでした[15]。 さらに、糞便卵数には季節的な傾向があります。 たとえば、イベリア半島のダマジカでは、消化管線虫による感染の強さの二峰性パターンが観察されました[65]。 したがって、いくつかの種の欠如または出現の少なさは、同様に低生長性によるものである可能性があります。 一方、EPG も共生栽培のサンプル量も種の存在量には影響しませんでした。 それにもかかわらず、私たちが調査したサンプルは主に秋の狩猟シーズン中にハンターから得られたものであるため、季節が結果に影響を与えた可能性を排除することはできません。 それにもかかわらず、我々は 31 種を特定し、その大部分 (68%) が複数の種類の宿主に存在していました。

この研究では、スウェーデンの 4 つの野生動物宿主のネマバイオームを研究しました。 私たちは、H. contortus と T. circumcincta が最も多かったヒツジに関する以前の研究とは対照的に、T. axei が最も一般的に同定された種であることを発見しました。 私たちの発見に基づいて、スウェーデンの野生動物は理論的には羊に伝染する可能性のある種に感染していると結論付けることができます。 しかし、宿主種間のネマバイオームプロファイルは非常に異なるため、このことが起こるリスクは低いと我々は評価しています。 いくつかの典型的な野生動物の線虫に加えて、侵入性寄生虫である S. houdemeri がスウェーデンで初めてダマジカ、アカシカ、ムフロンで見つかりましたが、Ashworthius Sidemi は存在しませんでした。 31 種を同定できたため、ネマバイオーム解析は強力なツールであると結論付けています。 いくつかは種レベルに割り当てることができませんでした。 したがって、将来的には、野生動物のネマバイオーム分析アプローチを使用して種の描写をさらに改善するために、形態学的に同定された標本の配列を決定することが重要/必要です。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。 生の ITS2 データは、BioStudies データベース (http://www.ebi.ac.uk/biostudies) でアクセッション番号 S-BSST527 として入手できます。

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著者らは、この研究にサンプルを提供してくれたすべてのハンターと Vidilab AB に感謝します。 さらに、著者らは、シーケンシング ライブラリの作成に対する SLU Metabarcoding Laboratory (UMBLA) と、大規模な並列シーケンシングおよび計算インフラストラクチャにおける支援の提供に対する National Genomics Infrastructure (NGI)/Uppsala Genome Center および UPPMAX のサポートに感謝します。 NGI/ウプサラ ゲノム センターで行われた研究は、RFI/VR およびスウェーデンの Science for Life Laboratory から資金提供を受けています。 グラフィックアブストラクトの動物のシルエットは、アンソニー カラヴァッジがクリエイティブ コモンズ表示 - 非営利 - 継承 3.0 非移植ライセンスに基づいてダマジカの絵を作成した phylopic.org からダウンロードされました (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/)。 ; Steven Traver はムフロンの写真を、Ferran Sayol はアカシカとノロジカの写真をパブリック ドメイン Dedication 1.0 ライセンス (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) に基づいて作成しました。 図 1 は、Natural Earth ベクトル データを使用して作成されました。

スウェーデン農業科学大学が提供するオープンアクセス資金。 この研究は、スウェーデンの Formas から JH への支援を受けました [助成番号 2018-02888]。

生物医学および獣医公衆衛生学部、スウェーデン農業科学大学、7036、750 05、ウプサラ、スウェーデン

ピーター・ハルヴァルソン、パリウス・バルトルシス、ヨハン・ヘグルンド

スウェーデン農業科学大学生態学部、グリムソ野生生物研究所、739 93、リッダヒッタン、スウェーデン

ペッター・ケランダー

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JH、PH、PK がこの研究を計画しました。 PH と PK はハンターからサンプルを整理して収集し、PH はデータを分析してすべてのグラフを作成しました。 PB はサンプルの逆多重化を行いました。 JH は PH の助けを借りて文献検索を行い、草稿を書きました。 PK は、シカの宿主に関する詳細を提供しました。 その後、著者全員が原稿をレビューし、最終版を承認しました。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

ピーター・ハルバーソンへの通信。

寄生虫は通常の狩猟中に殺された動物から収集され、定期的な獣医診断のために送られたため、この研究には倫理的な許可は必要ありませんでした。

適用できない。

著者らは、競合する利益を持たないことを宣言します。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Halvarsson, P.、Baltrušis, P.、Kjelander, P. 他スウェーデンの野生反芻動物の寄生線虫ネマバイオーム群集。 寄生虫ベクター 15、341 (2022)。 https://doi.org/10.1186/s13071-022-05449-7

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受信日: 2022 年 7 月 4 日

受理日: 2022 年 8 月 26 日

公開日: 2022 年 9 月 27 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-022-05449-7

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