代謝的に異なる微生物の食事選択が反芻動物の水素代謝を促進する

ISME Journal volume 16、pages 2535–2546 (2022)この記事を引用する

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メトリクスの詳細

反芻動物は世界の食糧安全保障にとって重要ですが、温室効果ガスであるメタンを排出します。ルーメンの微生物は複雑な炭水化物を分解して、揮発性脂肪酸と分子状水素を生成します。この水素は主に古細菌によってメタンに変換されますが、水素栄養性酢酸生成細菌や呼吸器細菌によって有用な代謝産物を生成するために使用されることもあります。食事性炭水化物が水素代謝とメタン生成にどのような影響を与えるかについては、より良いメカニズムの理解が必要です。私たちは、繊維が豊富な食餌またはでんぷんが豊富な食餌に適応した 24 頭の肉牛のルーメン微生物叢の組成、代謝経路、および活動をプロファイリングしました。線維分解菌とメタン生成菌に対しては繊維質の豊富な飼料が選択され、繊維利用が増加しましたが、デンプンの豊富な飼料はデンプン分解菌や乳酸利用者に対して選択され、健康な第一胃の維持が可能になり、メタン生成が減少しました（p < 0.05）。さらに、水素栄養性メタン生成菌とアセト生成菌が豊富な繊維質の豊富な食事は、電子分岐 [FeFe]-ヒドロゲナーゼ、メタン生成性 [NiFe]- および [Fe]-ヒドロゲナーゼ、アセチル CoA シンターゼの増加につながり、溶存水素は減少します (42%、 p < 0.001)。対照的に、デンプンが豊富な飼料は、より多くの水素を生成するグループ B [FeFe]-ヒドロゲナーゼと呼吸グループ 1d [NiFe]-ヒドロゲナーゼを含む呼吸器水素栄養栄養菌を強化しました。並行して行われた in vitro 実験では、繊維が豊富に選択されたマイクロバイオームが酢酸塩と酪酸塩の生成を促進する一方、メタン生成量は減少することが示され（p < 0.05）、このことは、濃縮された水素栄養性アセトゲンが、メタン生成に使用される一部の水素を変換したことを示唆しています。水素代謝とメタン生成に関するこれらの洞察は、反芻動物におけるエネルギーハーベスティング戦略、健康な第一胃の維持、メタンの軽減についての理解を深めます。

反芻動物は、細菌、古細菌、原生動物、真菌からなる複雑な反芻微生物生態系を保持するように進化してきました。これらの微生物は、複雑な植物細胞の炭水化物を、宿主動物が利用できる揮発性脂肪酸 (VFA) や微生物タンパク質に変換します [1、2]。分子状水素 (H2) は、嫌気性細菌、原生生物、真菌による炭水化物発酵中に生成され、主にルーメン内のメタン (CH4) 生成古細菌によって消費されます [3、4]。この H2 は、さまざまな細菌によってエネルギー源および電子供与体として消費され、発酵が熱力学的に有利な状態に保たれます [5]。水素サイクリングは、H2 結合部位の金属含有量に基づいて [FeFe]-、[NiFe]-、[Fe]-ヒドロゲナーゼに分類される H2 生成ヒドロゲナーゼと H2 消費ヒドロゲナーゼによって触媒されます [6]。ヒドロゲナーゼは細菌および古細菌のゲノムに広く分布しており、ルーメン発酵における H2 トランザクションの代謝的重要性を反映しています [5、7、8]。腸内発酵から生成されるメタンは、食事エネルギーの損失を意味するだけでなく、地球規模の人為的温室効果ガス排出にも寄与します [9、10]。重要なことは、ルーメン細菌は、CO2、フマル酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの電子受容体を使用して、水素栄養増殖のためにヒドロゲナーゼと末端レダクターゼもコードしていることです。メタン生成とは異なり、これらの代替水素栄養経路の一部は、宿主動物が利用できる代謝産物、たとえば水素栄養アセト生成を通じて酢酸を生成します[5]。したがって、水素栄養性細菌がルーメン H2 をめぐってメタン生成菌とどのように競合するかを理解することが重要です。この知識は、反芻動物の CH4 生産を減らしてエネルギーハーベスティングを強化する代謝戦略を促進する可能性があるからです。

食事の炭水化物の組成は、H2 代謝やメタン生成などの微生物の組成と機能を制御します [11、12]。セルロース系植物材料を与えると、ルーメン微生物は主に酢酸経路を通じてリグノセルロースを加水分解および発酵させて H2 を放出し、その結果高レベルの CH4 が生成されます [13]。しかし、カンガルーやヤクなどの一部の草食動物は CH4 の生成量が少ない [14、15]。水素栄養栄養性酢酸生成細菌は、Wood-Ljungdahl 経路を介して H2 と CO2 を酢酸塩に変換できます [5]。飼料の量や質が低い地域の一部の野生動物は、食事エネルギーの抽出と利用の効率を促進するために、水素栄養性アセト生成を強化した消化器系を進化させている可能性がある[16]。飼料の質が生成される H2 の運命を変え、それによって養殖反芻動物における水素栄養性アセト生成とメタン生成の比率やエネルギー収集の効率に影響を与えるかどうかは、まだ解明されていない。

広く使用されているにもかかわらず、デンプンが豊富な高穀物飼料は反芻動物の健康にリスクをもたらします。デンプンの多量摂取は、適応していない第一胃内での急速な VFA と乳酸の生成を刺激し、第一胃 pH の急速な、時には顕著な低下を引き起こします [17]。穀物に適応した動物であっても、第一胃の酸性状態が長く続くと、亜急性第一胃アシドーシスと呼ばれる状態[18]があり、飼料摂取量の減少、慢性炎症、第一胃乳頭の機能不全、その他の疾患を引き起こします[19]。酢酸塩の生成とは異なり、乳酸塩の生成は H2 生成とは関連せず、酸化還元補因子の再酸化（例、NADH から NAD+ へ）を促進します [20]。しかし、乳酸塩の pKa が VFA よりも低いことを考慮すると、その蓄積により第一胃の pH が低下するため、正常な第一胃機能を維持するには、乳酸利用細菌による乳酸塩のプロピオン酸塩および他の VFA への迅速な変換が必要です。 CH4 生成を低レベルに保ちながら第一胃の健康を促進するには、乳酸からプロピオン酸への変換がどのように制御されるかを理解することが重要です。

まとめると、これまでの研究は、第一胃微生物叢が、繊維が豊富な食事またはデンプンが豊富な食事に適応するために、異なる代謝戦略を示すことを示唆しています。しかし、食事の変化によって影響を受ける微生物叢や H2 代謝経路については、詳細なメカニズムの理解が不足しています。この知識のギャップに対処するために、我々は in vivo 実験を 1 回、in vitro 実験を 2 回実施し、繊維が豊富でデンプンが豊富な選択されたマイクロバイオームの第一胃モデルを開発しました。私たちは、繊維が豊富な飼料とデンプンが豊富な飼料を与えることにより、ルーメンマイクロバイオームの異なる組成、能力、活動が選択されることが観察されました。メタゲノムプロファイリングを使用して、これら 2 つの食餌を与えた結果生じる微生物叢が、下流のメタン生成経路と VFA 生成経路に違いがある、異なる炭水化物および H2 代謝経路を示していることを発見しました。この結果はまた、繊維豊富な食餌療法によるメタン生成以外の H2 シンクとしての水素栄養性酢酸生成のルーメンにおける潜在的な役割を示唆しており、これはメタン生成に利用できる H2 を競合し、宿主動物が利用できる余分なエネルギーを生成する可能性がある。この研究は、食事介入がルーメン微生物叢の組成を調節し、ひいては炭水化物の分解、H2代謝、およびメタン生成を調節することを強調しています。

実験に関与したすべての動物は、中国長沙市の中国科学院亜熱帯農業研究所動物管理委員会の動物管理および使用ガイドラインに従って飼育され、すべての動物実験手順は委員会によって承認されました（承認）番号 ISA-W-201901)。

合計 24 頭の在来種 (Xiangxi) 肉牛 (初期体重 147 ± 9.8 kg) を、3 期間 300 日間続く 2 つの食餌療法のうちの 1 つにランダムに割り当てました (図 1A)。繊維が豊富な飼料は、3 つの実験期間すべてで一定に保たれ、コーンストーバーと稲わらを含めることにより、飼料中性洗剤繊維 (NDF) 含有量が乾物 (DM) ベースで 40% を超えるように配合されました。各実験期間でコーンストーバーの 3 分の 1 をトウモロコシ粉 (DM ベース) に徐々に置き換え、期間 3 で濃縮物の 90% (DM ベース) に達するまで、デンプン含有量を増加させた 3 つのデンプンが豊富な飼料を配合しました (補足表 S1)。すべての牛には 1 日 2 回 (午前 7 時と午後 5 時) 餌が与えられ、飲料水は自由に摂取できました。

3 つの実験期間にわたる毎日の繊維およびデンプン摂取量 (kg/日) とルーメン pH の概要。 B 飼料の消化率、溶存水素 (H2)、乳酸塩および揮発性脂肪酸の生体内プロファイル。 C 飼料の分解、メタン (CH4) 生成および揮発性脂肪酸の in vitro ルーメン実験 1 のプロファイル。 D ルーメン乳頭の形態学的変化の検査。 E 空になったルーメンと屠体および乳頭の高さの比。 F 第一胃上皮における揮発性脂肪酸の吸収と細胞内 pH 調節に関連する遺伝子の q-PCR 結果。 OM有機物、NDF中性洗剤繊維、VFA揮発性脂肪酸、酢酸エース、プロピオン酸プロピレート、酪酸エステル；その他、吉草酸塩、イソ吉草酸塩、イソ酪酸塩。 HMGCL 3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA リアーゼ; HMGCS-1 3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA シンターゼ、アイソフォーム 1、HMGCS-2 3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA シンターゼ、アイソフォーム 2、NHE-1 Na+/H+ 交換体 1、NHE-2 Na+/H+ 交換体2、NHE-3 Na+/H+ 交換体 3、MCT-1 モノカルボン酸トランスポーター、アイソフォーム 1。エラーバー付きのデータは、平均 ± 標準誤差として表されます。 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、n = 12/グループ。

詳細については、補足資料と方法を参照してください。簡単に言うと、栄養素の消化率を 3 つの期間のそれぞれの 93 日目と 98 日目の間で測定しました。ルーメン内容物は、3 つの期間のそれぞれ 99 日目と 100 日目に、朝の給餌後 0、2.5、および 6 時間目に収集されました。ルーメンの pH と溶存水素濃度は、ルーメン内容物を収集した後すぐに測定されましたが、他のサブサンプルは DNA 抽出と発酵生成物の測定のために凍結されました。実験終了時にすべての牛を 12 時間絶食させて屠殺し、第一胃内容物と上皮サンプルを収集しました。

詳細な情報は、補足資料と方法で提供されます。本研究には、最終実験期間に実施された 2 回のバッチ培養ルーメン in vitro 実験が含まれていました。インビトロ実験 1 では、インキュベーション基質として繊維が豊富な飼料とデンプンが豊富な飼料の間で第一胃発酵を比較しました。各基質は、対応する食事を与えられた動物からのルーメン接種材料とともにインキュベートされました。インビトロ実験 2 では、繊維に富む食餌とでんぷんに富む食餌をそれぞれ与えた動物からのルーメン接種材料を稲わらに接種することにより、繊維に富む選択されたマイクロバイオームとでんぷんに富む選択されたマイクロバイオームの活性を比較しました。インビトロ第一胃発酵は、Wangらの手順に従って実施した。 [21]。

すべての詳細な分析手順は、補足資料と方法で提供されます。飼料と糞便の組成は、Association of Official Analytical Chemists [22]、Van Soest et al.の方法を使用して分析されました。 [23] およびカートナーとテウラー [24]。溶解した H2 と CH4 は第一胃内容物の液相から気相に抽出され、ガスクロマトグラフ (GC、Agilent 7890A、Agilent Inc.、パロアルト、カリフォルニア州) を使用して測定され、濃度は Wang らの式を使用して計算されました。 [25]。個々の揮発性脂肪酸 (VFA) 濃度は GC (Agilent 7890A、Agilent Inc.、パロアルト、カリフォルニア州) [25] で分析されましたが、乳酸塩の濃度は高速液体クロマトグラフィー (HPLC、Agilent LC1290、Agilent Inc) によって分析されました。、カリフォルニア州パロアルト）[26]。

[27] に記載されているように、ビーズの叩解とカラム濾過を繰り返して、ルーメンサンプルから DNA を抽出しました。ゲノムDNAを除去した後、第一胃上皮の全RNAを組織から抽出した。定量的リアルタイム PCR (q-PCR) を実行して、第一胃上皮における 7 つの遺伝子 (HMGCL、HMGCS-1、HMGCS-2、NHE-1、NHE-2、NHE-3、MCT-1) の相対的な遺伝子発現を測定しました。、その発現は 2-ΔΔCt 法を使用して参照遺伝子 (GAPDH および β-アクチン) に対して正規化されました [28]。特定の微生物分類群の絶対定量は、Ma et al. によって記載された手順に従って実行されました。 [29]。

研究に関係するすべてのバイオインフォマティクスソフトウェア、パラメーター、およびデータベースは、補足資料と方法に含まれています。簡単に説明すると、V3 および V4 領域を 16S rRNA 遺伝子配列決定に使用し、すべてのアンプリコンライブラリーの調製と配列決定を MiSeq プラットフォーム (Illumina、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) で実行しました。 DADA2 によるアンプリコン配列バリアント (ASV) の割り当てのために、サンプルあたり平均 51,606 ± 1737 リードで合計 1,238,536 の高品質リードが生成されました。分類には SILVA (リリース 138、http://www.arb-silva.de) を使用して注釈が付けられました。ショットガンメタゲノムシーケンシングでは、1 μg のゲノム DNA を Covaris S220 Focused-ultrasonicator (Woburn, MA USA) で切断し、約 350 bp (300 ～ 400 bp の範囲) の長さのシーケンシングライブラリを調製しました。メタゲノムライブラリの配列決定は、HiSeq X プラットフォーム (Illumina、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) でペアエンド 150 bp (PE150) モードで実行されました。品質管理、アセンブリ、予測、および非重複遺伝子セットへのクラスタリングの後、KEGG、CAZy、HydDB、および NCBI-NR を使用して遺伝子セットのアノテーションが実行され、サンプル全体内の遺伝子存在量が計算されました。微生物のゲノムは、多様な動物群の第一胃から培養された事実上すべての細菌および古細菌種を含む Hungate1000 コレクションを使用してさらに検証されました [30]。各ゲノムの存在量は、デフォルトのパラメーターを使用して metawrap quant_bins モジュールによって計算されました [31]。

代謝データは、SPSS 21.0 ソフトウェア (SPSS Inc.、イリノイ州シカゴ) の一元配置分散分析 (ANOVA) によって分析されました。サンプリング時間が含まれる場合、データは、サンプリング時間の相互作用を固定効果として、サンプリング時間を反復測定変数として、治療と治療による線形混合モデルを使用して分析されました。微生物群集組成データは、JMP Pro ソフトウェア (JMP Pro バージョン 13.2.1、SAS Institute Inc. SAS Institute、Cary、NC、USA) の Wilcoxon 順位和テストを使用して分析されました。属性のゲノムランクは、知識分析のためのワイカト環境 (WEKA) (バージョン 3.8.4、ハミルトン、ニュージーランド) のソフトウェアの相関、ReliefF、Symmetrical Uncert、およびマルチクラスター特徴選択 (MCFS) メソッドによって評価されました [32] 、RobustRankAggreg (RRA) R パッケージ [33] によってさらに包括的に分析されます。すべての p 値は、Benjamini-Hochberg 法を使用して偽発見率 (FDR) に合わせて調整されました。統計的有意性は p ≤ 0.05 で宣言され、傾向は 0.05 < p ≤ 0.10 で宣言されました。

動物は、3 回の 100 日間の実験期間にわたって、飼料濃縮物の含有量を 50% から 90% まで徐々に増加させることにより、デンプンの豊富な飼料に適応させました (図 1A)。どちらの食餌でも、ルーメンの構造と上皮の形態は堅牢で、ルーメンの pH は 6.0 以上を維持しており (図 1A、D、追加表 S4)、実験全体を通してルーメンの機能が健康であることを示しています。

繊維を多く摂取した牛は繊維の消化率が高かったが、でんぷんが豊富な飼料に適応した牛は有機物とでんぷんの消化率が高かったが、生体内および試験管内実験1では繊維の消化率が低かった（図1B、C、追加表S4、 p < 0.001)。デンプンの豊富な飼料に適応した牛はより高い炭水化物分解速度を示し、生体内での期間 1 と 2 (追加の表 S4)、および生体外実験 1 (図 1C、p < 0.001) で総 VFA 濃度の増加につながりました。。デンプンに富む食餌を与えた期間 3 で in vivo で観察された VFA 濃度の低下 (p < 0.01) は、一部のビタミンのコピー数の増加が示唆するように、VFA の吸収率が産生よりも大きく増加した結果である可能性があります。第一胃上皮における VFA 吸収と細胞内 pH 調節に関連する遺伝子 (図 1F)、すなわちケトン生成の制限酵素 3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA リアーゼ (HMGCL)、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA シンターゼアイソフォーム 2 (HMGCS-2)、Na+/H+ 交換体 2 (NHE-2)、および Na+/H+ 交換体 3 (NHE-3) [34、35、36]。食餌間の VFA 吸収の変化は、第一胃器官の構造の変化によっても示唆されており、でんぷんが豊富な食餌では第一胃器官対枝肉の比率が低く、第一胃乳頭が短くなります（図 1D、E）。

酢酸塩のモルパーセントおよび酢酸塩とプロピオン酸塩のモル比は、繊維の豊富な飼料に適応した牛の方が高かった（p < 0.001）。このような VFA プロファイルの違いは、インビトロルーメン発酵の結果と一致します (図 1B、C、追加の表 S4)。デンプンが豊富な食事は第一胃溶存 H2 (dH2、2.5 倍) を増加させ (p < 0.001)、CH4 生成を減少させました (p = 0.003)。まとめると、これらの結果は、おそらく異なる微生物の活動の促進により、2 つの食餌が VFA 生産、H2 代謝、およびメタン生成に異なる影響を与えることを示唆しています。

16S rRNA 遺伝子配列決定を使用してルーメン微生物群集の組成を調べました。 24 個のサンプル全体で、3028 個のアンプリコン配列変異体 (ASV) が観察されました。重み付けされていない UniFrac の非類似性に基づいて、微生物組成は食餌によって明らかにクラスター化されており (図 2A)、炭水化物の種類が微生物群集組成の顕著な変化を引き起こしたことを示しています。さらに、グループを分類するためにランダムフォレストをさらに適用し、食餌による細菌群集の分類精度の平均減少率によってランク付けされた 20 の最も重要な細菌属を選択しました (図 2B、追加ファイル S1)。それらの中で、ルミノバクターおよびサクシニビブロナ科UCG-002は、でんぷんが豊富な食事の2つの最も代表的な属であり、繊維が豊富な食事の場合はフィブロバクターが最も代表的な属でした。さらに、これらの代表的な細菌属の相関ネットワーク分析により、各治療内で強い正の相関があり、治療間の負の相関が明らかになりました（p < 0.05、スピアマン| r | > 0.5、追加の図S3）。

分類群 (ASV) レベルでの重み付けされていない UniFrac 非類似性行列に基づく第一胃細菌群集の主座標分析 (PCoA) プロファイル (PERMANOVA、p = 0.001、R2 = 0.19)。 B 第一胃細菌群集のランダムフォレスト分析。 y 軸は、上から下に、グループの分類における平均減少精度に基づいて、相対的な重要性によってランク付けされた属を表示します。 C 上位 5 門の相対的な存在量。 D フィブロバクター属、ルミノバクター属、およびトレポネーマ属の相対的な存在量。 E 飼料の消化率および揮発性脂肪酸と属レベルでの細菌群集との関係 (平均パーセント > 0.5%)。ランクがないということは、属レベルで特定の分類情報がないことを意味します。スピアマンの有意水準 p < 0.05 のみが示されており、黄色と青色はそれぞれ陰性と陽性の補正を示します。 OM有機物。 NDF中性洗剤繊維です。独立した 2 グループのウィルコクソン順位和検定を使用して有意性を検定しました。エラーバーのあるデータは平均値±標準誤差として表されます。 **p < 0.01、***p < 0.001、n = 12/グループ。

門レベルでは、バクテロイドータ属（Bacteroidetes）とフィブロバクテロータ属（Fibrobacteres）は繊維豊富な食事で有意に豊富でしたが、プロテオバクテリアとスピロヘトータ属（Spirochaetes）はでんぷん豊富な食事でより豊富でした（図 2B、p < 0.001）。使用したプライマーペアの特異性（V3-V4プライマーをターゲットとする）により、スピロヘトータと古細菌はこの分析では過小評価される可能性があることに注意してください[37、38]。属レベルでは、フィブロバクター属（37.3 倍）、クリステンセンネラ科 R-7 グループ（2.6 倍）、およびバクテロイダル目 RF16 グループ（4.0 倍）は繊維が豊富な飼料で強化されたのに対し、ルミノバクター属（12.0 倍）デンプンが豊富な食事では、トレポネーマ（6.9 倍）、サクシニビブリオ科 UCG-002（21.8 倍）が豊富でした（図 2D、追加の図 S2、p < 0.001）。これらの属のうち 4 つは、ランダムフォレスト分析に基づくと、最も高い識別力を持つ属にも含まれていました (図 2B)。さらに、フィブロバクター、バクテロイダル科 RF16 グループ、およびクリステンセンネラ科 R-7 グループは、酢酸濃度および中性洗剤繊維 (NDF) 消化率と正の相関があり、ルミノバクター、サクシニビブリオ科 UCG-002、およびトレポネーマは、プロピオン酸濃度およびデンプン消化率と正の相関がありました (図２Ｅ）。したがって、微生物組成の違いは、異なる基質の好みと分解能力に関連しています。

ホストに割り当てられたリードを削除した後、サンプルあたり平均 21.0 Gb (17.4 ～ 29.1 Gb の範囲) となる 503 Gb のペアエンドシーケンスデータを取得しました。私たちは最初に、京都遺伝子ゲノム百科事典 (KEGG) を使用してルーメンマイクロバイオームの代謝能力を調査しました [39]。 KEGG Orthology (KO) データベースと KEGG 経路にそれぞれ割り当てられた遺伝子は 71.4 % と 33.9% でした。すべての KO 遺伝子の主座標分析 (PCoA) により、食物繊維が豊富な食事とデンプンが豊富な食事は、さまざまな代謝機能に合わせて選択されており (図 3A)、「炭水化物代謝経路」が食事間で大きく異なる最も豊富なカテゴリーであることが示されました (追加図S4)。

すべての KO 遺伝子の PCoA プロファイル (PERMANOVA、P < 0.001、R2 = 0.70)。 B CAZymes 遺伝子全体の相対的な存在量。 C GH ファミリーの PCoA プロファイル (PERMANOVA、P < 0.001、R2 = 0.64)。 D 上位 5 つの GH ファミリー酵素の遺伝子存在量、および門ごとに濃縮されたそれらの系統分布 (AA 補助活性、CBM 炭水化物結合モジュール、CE 炭水化物エステラーゼ、GH グリコシドヒドロラーゼ、GT グリコシルトランスフェラーゼ、PL 多糖リアーゼ)。 KEGG 酵素の酢酸、酪酸、プロピオン酸、およびメタン生成経路を、繊維に富んだ処理とデンプンに富んだ処理のアライメント比 (log2 比) として表します。円グラフは、門での各処理で濃縮された経路の系統分布を示します。 Ace-P 酢酸生成経路、Pyr-But-P ピルビン酸から酪酸生成経路、Ace-But-P 酢酸から酪酸生成経路、Pro-Lac-P プロピオン酸 (乳酸) 経路、Pro-Suc-P プロピオン酸 (コハク酸) 経路, メタン生成経路に出会った。濃縮された経路内のすべての KO 遺伝子は、特定された門に割り当てられました。すべての KO 遺伝子の詳細と、同定された属および経路は追加のファイル S4 および S5 にあります。独立した 2 グループのウィルコクソン順位和検定を使用して有意性を検定しました。エラーバーのあるデータは平均値±標準誤差として表されます。アスタリスクは、有意に調整された p 値を示します: **p < 0.01、***p < 0.001、n = 12/グループ。

組み立てられたメタゲノムコンティグ内の炭水化物活性酵素 (CAZyme) をスクリーニングしました (追加ファイル S2)。デンプンの摂取量が多いと、補助活性 (AA)、炭水化物結合モジュール (CBM)、および糖転移酵素 (GT) を含む総 CAZyme の量が増加しました (p = 0.01) (図 3B)。さらに、上位 5 つの炭水化物活性酵素クラスと上位 10 に割り当てられた門または属のランクは、2 つの処理間で異なりました (追加の図 S5)。 GH は 6 つの CAZyme クラスの中で相対存在量が最も高く、GH サブファミリーの存在量は 2 つの食餌療法間で大きく異なりました (図 3C)。繊維が豊富な食事は、β-キシロシダーゼ GH43 がより豊富に含まれるように選択され (p = 0.001、1.3 倍高)、これは属レベルでプレボテラ、バクテロイデス、およびフィブロバクターに割り当てられました (追加の図 S6)。 α-アミラーゼ GH13 の存在量はデンプンが豊富な食事の方が高く (図 3D、追加ファイル S3、p < 0.001、1.4 倍高)、プレボテラ、ルミノバクター、クロストリジウムに割り当てられました (追加図 S6)。したがって、どちらの食事療法も、炭水化物を消化する明確な能力を持つ細菌群集を促進しました。

次に、酢酸、プロピオン酸、酪酸、メタン生成の経路に関連する酵素をコードする遺伝子の豊富さを分析しました (追加ファイル S4)。繊維が豊富な食事は、酢酸生成（pta 遺伝子）、酢酸から酪酸への生成（acs 遺伝子）、中間体としてのコハク酸を介したプロピオン酸生成（MUT および sdhA 遺伝子）、およびメタン生成（mcrA および mcrB 遺伝子）の経路を強化します。プロピオン酸生成のアクリレート経路（ldhおよびpct遺伝子）が強化されたデンプンが豊富な食事（図3E、追加の図S7、p < 0.05）。バクテロイドータ属、ファーミクテス属、およびプロテオバクテリアは、デンプンが豊富な食事におけるアクリル酸経路に割り当てられた主要な門でした。繊維が豊富な食では、フィブロバクテリオタ属が酢酸塩とプロピオン酸塩の発酵生産において顕著であり、予想通り、ファーミクテス属が酢酸塩から酪酸塩への生産経路の主要な門であり、メタノバクテリオタ属 (ユーリアーキオータ) がメタン生成に割り当てられた門でした (図 3E、追加)ファイルS5)。

VFA プロファイル、dH2 濃度、CH4 生成に有意な差が観察されたことを考慮して (図 1B、C)、組み立てられたコンティグ内の H2 生成酵素と H2 消費酵素の触媒サブユニットをコードする遺伝子をスクリーニングしました。同定された 2,686 個の遺伝子のうち、82%、17%、1.2% にそれぞれ [FeFe]-、[NiFe]-、[Fe]-ヒドロゲナーゼとして注釈が付けられました。ヒドロゲナーゼは、バクテロイデス属、クロストリジウム属、オシリバクター属、メタノブレビバクター属、およびルミノコッカス属を含む 149 属に分類学的に割り当てられました (追加ファイル S6)。 2 つの食餌は異なるヒドロゲナーゼ組成を示したので (追加の図 S8)、次にヒドロゲナーゼをサブグループに分類しました。三量体グループ A3 [FeFe]-ヒドロゲナーゼは、H2 生成につながる発酵炭水化物分解中の電子集合プロセスを媒介し [40]、両方の処理で最も豊富なヒドロゲナーゼでした (図 4A)。これらのヒドロゲナーゼのジアホラーゼサブユニット (HydB) は、繊維が豊富な食事で高度に濃縮され (p < 0.01、1.8 倍高)、門レベルで主にファーミクテス属とバクテロイドータによってコードされていました (追加ファイル S6)。

A 門ごとに割り当てられたヒドロゲナーゼ遺伝子の分布。関連する末端レダクターゼの B 遺伝子分布は門によって割り当てられます。発酵性ヒドロゲナーゼ (グループ B、A1 および A2 FeFe ヒドロゲナーゼ)、電子分岐ヒドロゲナーゼ (グループ A3 および A4 FeFe ヒドロゲナーゼ)、エネルギー変換ヒドロゲナーゼ (双方向; グループ 4a、4c、4d、4e、4f、および 4g NiFe ヒドロゲナーゼ) )、メタン生成性ヒドロゲナーゼ (Fe-ヒドロゲナーゼ、グループ 3a、3c、4h、4i および 1k NiFe-ヒドロゲナーゼ)、呼吸性ヒドロゲナーゼ (グループ 1a、1b、1c、1d、1k、2a)、感覚性ヒドロゲナーゼ (グループ C FeFe-ヒドロゲナーゼ) 。 HydB ヒドロゲナーゼ関連ジアホラーゼ。 NifHニトロゲナーゼ。 H2 取り込み経路は、フマル酸還元 (FrdA フマル酸レダクターゼ)、硝酸アンモニア化 (NrfA、アンモニア形成亜硝酸レダクターゼ、NarG、異化性硝酸レダクターゼ、NapA、ペリプラズム硝酸レダクターゼ)、硫酸塩および亜硫酸塩の還元 (AprA アデニリル硫酸レダクターゼ、AsrA 代替酵素) と連動する可能性があります。亜硫酸レダクターゼ、DsrA、異化性亜硫酸レダクターゼ）、ジメチルスルホキシドおよびトリメチルアミンのN-オキシド還元（DmsA DMSOおよびTMAOレダクターゼ）、還元的アセト生成（AcsB、アセチルCoAシンターゼ）、好気呼吸（CydAシトクロムbdオキシダーゼ）、およびメタン生成（McrA）メチル-CoM レダクターゼ)。ランクがないということは、門レベルで特定の分類情報がないことを意味します。平均相対存在量 > 1 の遺伝子のみが表示され、その他の遺伝子は追加のファイル S6 に表示されました。独立した 2 グループのウィルコクソン順位和検定を使用して有意性を検定しました。エラーバーのあるデータは平均値±標準誤差として表されます。 **p < 0.01、***p < 0.001、n = 12/グループ。

繊維が豊富な食事は、メタノバクテリオータによってコードされるメタン生成ヒドロゲナーゼ（グループ 3a [NiFe]-ヒドロゲナーゼおよび [Fe]-ヒドロゲナーゼ）の遺伝子を強化しました（図 4A、p < 0.05、1.5 倍高い）。デンプンが豊富な食事では、発酵グループ B [FeFe]-ヒドロゲナーゼ (p < 0.01、2.2 倍高)、エネルギー変換グループ 4e および 4g [NiFe]-ヒドロゲナーゼ、呼吸グループ 1d [NiFe]-ヒドロゲナーゼ、感覚グループ C3 [FeFe]-ヒドロゲナーゼ (図 4A、p < 0.05)。これらは分類学的に主にファーミクテス属とスピロヘトータ属に割り当てられました (追加ファイル S6)。これらの結果は、デンプンの豊富な食餌により H2 流量が増加したことを示唆しており、これはより多くの発酵とより高いルーメン dH2 濃度と一致していました (図 1B)。

我々はさらに、メタン生成、アセト生成、フマル酸還元、スルフィド生成、硝酸還元、好気呼吸などの水素栄養増殖をサポートする特徴的な遺伝子を分析しました[5]。繊維が豊富な食餌は、主にメタノブレビバクターに関連するメチル-CoM レダクターゼ (mcrA、図 4B、p = 0.009、1.6 倍高い) などのメタン生成に関連する特徴的な遺伝子に対して選択されました (追加ファイル S6)。でんぷんが豊富な食事は、水素栄養呼吸をサポートすることが知られている膜結合型酵素であるファーミクテスによってコードされるグループ 1d [NiFe]-ヒドロゲナーゼ (p < 0.05) と、硫酸塩還元の特徴的な遺伝子 (aprA) をより多く含むために選択されました。、p = 0.002、3.0 倍高い）。予想外の結果は、水素栄養性アセト生成のマーカー遺伝子 (アセチル-CoA シンターゼ、acsB、p < 0.01) が、繊維が豊富な食事では 3 倍豊富であったということでした (図 4B)。アセチルCoAシンターゼは可逆酵素であり、例えばさまざまな硫酸塩還元細菌における酢酸利用を媒介する[41]が、ほとんどの読み取り（約75％）は酢酸生成性ファーミクテスの読み取りと最も密接に関連していた。

組み立てられたゲノムの Hungate1000 コレクションには、さまざまな反芻動物種の第一胃から培養された事実上すべての細菌種と古細菌種が含まれています [30, 42]。この研究の結果を菌株レベルでより深く理解するために使用されました。。各サンプルから 100 万件のランダムリードが抽出され、Hungate1000 ゲノムとアライメントされた結果、平均マッピング率は 20.2% となりました (追加の図 S9)。我々は、257ゲノムと168ゲノムが、それぞれ繊維が豊富な食事とデンプンが豊富な食事によってより豊富であることを発見しました（追加の図S10）。 GH43 をコードするゲノムは、繊維が豊富な食事でより豊富になり、バクテロイデス、プレボテラ、およびフィブロバクターに割り当てられましたが、GH13 をコードするゲノムは、デンプンが豊富な食事でより充実し、ルミノバクターとクロストリジウムに割り当てられました。繊維が豊富な食事は、独特のヒドロゲナーゼ (グループ 3a、3c、4h、4i [NiFe]-ヒドロゲナーゼおよび [Fe]-ヒドロゲナーゼ) と特徴遺伝子 mcrA を保有する推定メタン生成ゲノム 10 個のうち 8 個を選択し、さらに推定 5 個も選択しました。電子分岐ヒドロゲナーゼ (グループ A3、A4 [FeFe]-ヒドロゲナーゼ) または特徴的遺伝子 acsB をコードする 8 つの水素栄養性アセト生成性細菌ゲノムのうち。ラクノスピラ目とセレノモナダ目に割り当てられた発酵性ヒドロゲナーゼ（グループA1、A2、およびB [FeFe]-ヒドロゲナーゼ）をコードする130のゲノムのうち67、および呼吸器ヒドロゲナーゼをコードする33のゲノムのうち17（グループ1および2a [NiFe]-ヒドロゲナーゼ) はセレノモナダ目に割り当てられています。末端硫酸および亜硫酸レダクターゼを有するこれらのゲノムは、デンプンに富む食餌によりさらに濃縮され、主にラクノスピラ目（追加ファイル S7）に割り当てられました。

2 つの処理間の存在量の差に基づいて、属性のランクの分析を実行しました。フィブロバクター・サクシノゲネス亜種 elongatus HM2 株と Lachnospiraceae 細菌 AC2028 は、どちらも繊維分解における機能を持ち [30]、繊維が豊富な食事で強化された最も代表的なゲノムでした (p < 0.001)。両方のルミノバクター sp. RM87 および Succinimonas amylolytica DSM 2873 は、デンプンを分解することが知られており [30]、デンプンが豊富な食事の最も代表的なゲノムでした (図 5A、p < 0.001、追加の図 S11)。我々は、q-PCRによって、F. succinogenesとRuminobacter amylophilusの16S rRNA遺伝子コピーが、それぞれ繊維が豊富な処理とデンプンが豊富な処理でより豊富であることを検証しました（追加の図S12、p < 0.001）。繊維分解の促進は、インビトロ実験 2 によってさらに検証され、繊維の豊富な食餌をマイクロバイオームに接種すると、NDF 分解が大きくなることが示されました (図 5B、p = 0.026)。

代表的な微生物の代謝の特徴。各サンプルからのリードは、burrows-wheeler アライメントツールを使用して、Hungate1000 コレクション内の培養ルーメン微生物の配列決定されたゲノムとアライメントされました。既知の増殖特性 [5, 30] に基づく各微生物のヒドロゲナーゼ機能、基質利用、代謝産物生産は、それぞれ青、オレンジ、緑で色付けされています。各ゲノムに対する繊維豊富/デンプン豊富なサンプルのアライメント間の比率が表示され、データは log2 (比率) として表されました。ゲノム属性: 線維分解性細菌、Fibrobacter succinogenes subsp. elongatus HM2 株およびラクノスピラ科細菌 AC2028。デンプン分解細菌、ルミノバクター sp. RM87およびSuccinimonas amylolytica DSM 2873; 酢酸塩生産者、ラクノスピラ科細菌 G41 およびフィブロバクターサクシノゲネス亜種エロンガタス株 HM2。酪酸生産者、ラクノスピラ科細菌 AC2028 および Butyrivibrio sp. LB2008; 乳酸利用者およびプロピオン酸生産者、メガスファエラエルスデニ J1 株およびアナエロビブリオリポリティクス LB2005。水素栄養性メタン生成菌、Methanobrevibacter thaueri 株 DSM 11995 および sp. 315円; アセトゲン、Acetitomaculum ruminis DSM 5522。他のゲノムの詳細情報は追加ファイル S7 に示されています。繊維が豊富またはデンプンが豊富な選択されたマイクロバイオームを接種することによる稲わら発酵による in vitro ルーメン実験 2 の B メタン (CH4) 生成、中性洗剤繊維 (NDF) 分解、pH および揮発性脂肪酸 (VFA) プロファイル。エラーバーのあるデータは平均値±標準誤差として表されます。 **p < 0.01、***p < 0.001、n = 12/グループ。

我々は、酢酸塩、プロピオン酸塩、または酪酸塩を生成すると推定される微生物の最も異なる 2 つの豊富なゲノムを選択しました (追加ファイル S7)。繊維が豊富な食事のマイクロバイオームは、ラクノスピラ科細菌 G41 および AC2028、F. succinogenes subsp. が豊富に含まれている一方で、酢酸塩と酪酸塩の生成に有利でした。 elongatus HM2 株、Butyrivibrio sp. LB2008（p < 0.01）、一方、デンプンの豊富な食餌のマイクロバイオームは、メガスファエラエルスデニ J1 株およびアナエロビブリオリポリティクス LB2005 の濃縮とともに、中間体として乳酸を使用したプロピオン酸の生産を促進しました（p < 0.001、追加図 S11）。これらの結果は、繊維が豊富またはデンプンが豊富な選択されたマイクロバイオームを接種した稲わらをインキュベートすることによるインビトロ実験２によってさらに検証された（図５Ｂ）。したがって、6つの代表的なゲノムのうち5つは発酵性、電子分岐性およびエネルギー変換性のヒドロゲナーゼをコードしており、一方、1つのゲノム（すなわち、メガスファエラ・エルスデニイJ1株）は、VFA産生の基質としてH2を使用する能力を有していた（図5A）。これらの結果は、VFA 生成と H2 代謝の異なる経路を持つマイクロバイオームのために食事性炭水化物が選択されることをさらに裏付けました。

我々は、水素栄養性メタン生成 (mcrA) および酢酸生成 (acsB) のマーカー遺伝子をコードするゲノムを選択しました。最も異なって豊富なゲノムは、Methanobrevibacter thaueri 株 DSM 11995 および sp. 11995 でした。 YE315、および水素栄養性アセトゲンである Acetitomaculum ruminis DSM 5522 [43]、これらはすべて繊維豊富な食事で強化されました（図 5A および図 S11、p < 0.01、追加ファイル S7）。 M. タウエリ株 DSM 11995 および sp. 11995 の両方。 YE315 は、H2 を使用して CO2 を CH4 に還元するメタン生成ヒドロゲナーゼをコードしますが、A. ruminis DSM 5522 は、H2 を使用して CO2 を酢酸に還元すると予測される電子分岐グループ A3 [FeFe]-ヒドロゲナーゼをコードします (図 5A)。 acsB 遺伝子は、一部の酪酸生成細菌 (例、Eubacterium limosum) にもコードされており、Wood-Ljungdahl 経路を通じて酢酸を生成し、それを酪酸に変換します [44、45]。次に、稲わらが唯一の基質である in vitro 実験 2 では、繊維が豊富な選択されたマイクロバイオームの接種により、デンプンが豊富な選択されたマイクロバイオームと比較して CH4 が低下し、酢酸塩と酪酸塩の生成が増加することが示されました (図 5B、p < 0.05)。）。これは、繊維が豊富な食事が水素栄養性アセトゲンを選択した可能性を示唆しており、水素栄養性アセトゲンは酢酸生成のためのメタン生成に使用されるはずの水素の一部を使用する可能性があります。

繊維が豊富な食餌は、線維分解性細菌（例えば、フィブロバクターおよびルミノコッカス）について選択され、キシロシダーゼをコードする遺伝子（例えば、ＧＨ４３、図６Ａ）について富化されている。食物繊維の豊富な食餌によって促進される特徴的なマイクロバイオームと代謝戦略は、過酷な環境条件で暮らす反芻動物にとって重要である可能性が高く、低品質の植物バイオマスを消化して発酵させて、宿主動物が維持のために使用するVFAを生成することができます。繁殖、そして成長。チベットの反芻動物は、低品質の飼料を消化するのによく適応している[15、46]が、低地反芻動物よりも多くの線維分解性細菌、特にルミノコッカス・アルバス（100倍）とF.サクシノゲネス（50倍）を保有していることが示されている。より高い）[47]。ラクダは、不毛の砂漠草原に生息し、希少植物の木化した最も粗い部分を利用できるため、ウシやヒツジなどの家畜の反芻動物と比較して、同様に繊維を分解するルーメン細菌が豊富に存在する[48、49]。さらに、飼料の繊維含有量が増加すると、ブタ [50]、馬 [51]、ウサギ [52] などの非反芻動物の後腸でも繊維分解細菌が豊富になる可能性があります。繊維利用を強化するための繊維分解細菌の増殖は、宿主動物が木化飼料を食べることに適応するための重要な代謝戦略となり得る。しかし、繊維豊富な処理による繊維分解細菌の濃縮は、CH4 生成の増加と関連しており、食事のエネルギー利用効率の低下につながる可能性があります。

Hungate1000 コレクションの酵素、微生物、代謝物、経路リクルートに関する統合分析。「+ H2」、H2 が生成されます。「- H2」、H2が消費されます。各グループの酵素または微生物の倍率変化 (左: 繊維が豊富/デンプンが豊富、右: デンプンが豊富/繊維が豊富) はさらにラベル付けされ、追加ファイル S8 に詳細に表示されます。 B は第一胃 H2 代謝モデルを提案しました。代表的な種または属および対応するヒドロゲナーゼを矢印の隣に示し、図から抽出したものである。 1B、C、4A、5、および追加ファイル S8。実線と点線（四角）は、それぞれ経路の増強と減少の傾向を示しました。 H2水素。上向きの矢印は代謝物の増加。下向きの矢印は代謝物の減少を示します。

この研究の最初の重要な発見は、繊維が豊富な食事は、でんぷんが豊富な食事と比較して、水素栄養性アセトゲン（アセチトマクラム種など）のアセチルCoAシンターゼをコードするacsB遺伝子の量が増加したことである。水素栄養性アセトゲンは、高飼料食を与えられた牛やカンガルーの第一胃および前腸の微生物生態系、および木を食べるシロアリの後腸から単離されている[14、43、53]。一部の第一胃水素栄養性酢酸生成菌（例、Acetitomaculum）は、無機基質（H2/CO2）と有機基質（例、セロビオースおよびグルコース）をエネルギー源および炭素源として同時に使用する能力を持っていますが、他のもの（例、Blautia sp. Ser8）はエネルギー源および炭素源として使用しません。グルコースの存在下で H2 を生成すると、唯一の還元された最終生成物として酢酸が生成されます [16、54]。他の研究との矛盾の1つは、デンプンが豊富な食事ではスピロヘトータがより豊富に観察されたのに対し、スピロヘトータは繊維が豊富な食事によって刺激され、他の動物宿主では水素栄養性アセトゲンとなり得ることが示されているということである[55、56、57]。私たちの発見が群集構成のプロファイリングに使用されたプライマーの特異性によってさらに悪化するかどうかは不明です。それにもかかわらず、メタゲノム分析および活性ベースの分析は、発酵による酢酸生成に加えて酢酸生成細菌の存在量の増加も、繊維が豊富な食事による酢酸生成の増加に寄与する可能性があることを示唆しています。一部の酪酸生成細菌（Eubacterium limosumなど）はアセチルCoAシンターゼのacsB遺伝子をコードしているため、繊維が豊富な選択されたマイクロバイオームによって生成される酪酸のより多くの割合が酢酸プールを通過できます。

次に、この研究は、繊維が豊富な食餌によって選択されたルーメン微生物群集における水素栄養性アセト生成の考えられる役割についての新たな洞察を提供する。研究では、メタン生成菌は、水素栄養性アセト生成と比較して、H2 に対する親和性が高く、メタン生成における H2 利用のギブスエネルギー変化が低いため、アセト生成と競合できることが報告されています [7, 58]。古典的な理論では、第一胃内 H2 濃度の上昇によるメタン生成阻害シナリオにおいて、アセトゲンの刺激が代謝水素を酢酸生成に向け直す効果的な戦略である可能性があると考えられています [5]。しかし、本発明者らは、繊維が豊富な食餌中のdH2濃度が低いほど、水素栄養性アセト生成のマーカー遺伝子（例えば、acsB）の存在量が増加することを発見した。唯一の基質として稲わらを用いた我々の in vitro 実験 2 では、繊維が豊富な選択されたマイクロバイオームを接種すると、デンプンが豊富な選択されたマイクロバイオームと比較して、逆説的に酢酸生成が促進され、CH4 生成が減少することが示されました。これらの結果は、繊維が豊富に選択されたマイクロバイオームにおける水素栄養性アセトゲンのより大きなコミュニティが、おそらくメタン生成菌と H2 をめぐって競合する可能性があることを示唆しています。高地の反芻動物であるヤクやチベットヒツジは、低地のウシやヒツジと比べてCH4生成が少なく、酢酸塩の生産を好むのではないかという推測がなされている[15、59]。水素栄養性酢酸生成への分子状水素の取り込みは、形成される酢酸塩の約 1% に寄与し、ヒツジのルーメン液を接種した in vitro 培養物に取り込まれる総還元当量の 1 ～ 2% を占めると推定されています [60]。アセトゲンによって合成される酢酸塩の刺激は、温室効果ガス CH4 の排出量を削減するだけでなく、宿主動物のエネルギー利用効率の改善にも役立つでしょう。このようなエネルギーハーベスティングの経路は、低品質の餌を与えられた反芻動物にとっての競争戦略となる可能性がある。

デンプンの多量摂取は一般に pH の低下をもたらし、さらには無症候性または乳酸ルーメンアシドーシスを引き起こす [17]。我々は、食餌性デンプンを90%まで徐々に増加させても、乳酸濃度が大幅に増加したにもかかわらず、pHを6.0未満に下げたりルーメン上皮に害を与えたりすることはないことがわかりました。アクリレート経路を利用して乳酸をプロピオン酸に変換する M. elsdenii および A. liplyticus の濃縮は、アシドーシスを回避するために重要であると考えられます。報告によると、M. elsdenii は第一胃内で生成される乳酸の 60 ～ 80% を利用しており [61]、高濃度飼料を与えられた動物の第一胃内での乳酸利用者の 20% を占めている [62]。 A. lipolyticus は乳酸を利用し、最終生成物としてプロピオン酸を生成することもできます [63、64]。乳酸塩の蓄積を防ぐ [17, 65] ことに加えて、乳酸塩のプロピオン酸塩への変換は還元剤を NADH に取り込むため、H2 生成と最終的にはメタン生成と競合します [66]。乳酸をアクリル酸を介してプロピオン酸に代謝する細菌の強力なコミュニティは、乳酸の蓄積を防ぎ、健康な第一胃の維持に役立ちます。

この研究の 2 番目の重要な発見は、繊維に富む選択されたマイクロバイオームとデンプンに富む選択されたマイクロバイオームの両方において、電子分岐グループ A3 [FeFe]-ヒドロゲナーゼが第一胃 H2 生成の主要なメディエーターであると推測されたことです。この結果は、第一胃内での電子共鳴による H2 生成の重要性に関する発見と一致しています [67]。同様に重要なのは、ヒドロゲナーゼの存在量の違いと、2 つの食事によって促進されるメタン生成との関係です。繊維が豊富な食餌はルーメンの dH2 濃度を低下させ、電子分岐グループ A3 [FeFe]-ヒドロゲナーゼの HydB サブユニットの存在量を増加させました。デンプンが豊富な食事はルーメンの dH2 濃度を高め、発酵性グループ B [FeFe]-ヒドロゲナーゼ、および嫌気性条件下でのフェレドキシンの酸化と H2 生成を結び付けるエネルギー変換 4e および 4g [NiFe]-ヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の量を増加させました。ファーミクテス属およびスピロヘトータ属を含む細菌（図６Ａ）。でんぷんが豊富な食事によるルーメンの dH2 濃度の上昇は、メタン生成性 [NiFe] および [Fe]-ヒドロゲナーゼ、ならびに水素栄養性メタン生成を媒介するメチル-CoM レダクターゼをコードする遺伝子の量の減少を伴い、これは CH4 生成の減少と一致しています。。濃縮物からの CH4 生成の減少を説明するメカニズムは、メタン生成菌のより速い増殖速度および/またはより低い最大増殖速度に基づいて H2 濃度が増加し、その結果、酢酸塩と H2 生成が熱力学的に好ましくなくなり、最終的に CH4 生成に利用できる H2 が少なくなることに基づいています。は以前に提案されています[7]。でんぷんが豊富な飼料ではメタン生成ヒドロゲナーゼの存在量が減少するという我々の発見は、その提案と一致している。なぜなら、第一胃からの流出速度が速くなり、濃厚飼料に関連して第一胃内pHが低下すると、第一胃内に存在するメタン生成菌とメタン生成酵素がおそらく少なくなるからである。 H2 濃度が高くなると、プロピオン酸生成などの H2 取り込み経路が熱力学的に有利になります。これは、ファーミクテス属に属する呼吸性 1d [NiFe]-ヒドロゲナーゼおよび推定上の感覚性 C3 [FeFe]-ヒドロゲナーゼの存在量の増加と一致し、水素栄養性呼吸をサポートします（例、セレノモナス）[5]。

全体として、我々の結果は、反芻動物に与えられる炭水化物の種類が、ルーメンのメタン生成とVFAの産生およびプロファイルに密接に関連している、独特のH2代謝によってルーメンマイクロバイオームの組成と機能を変化させることを示しています（図6B）。繊維が豊富な食事は、繊維分解性細菌を強化し、繊維利用を強化し、酢酸塩と H2 の生成を促進し、メタン生成菌の存在量が増加し、CH4 の生成が増加し、H2 濃度が減少しました。繊維に富んだ選択されたマイクロバイオームによる酢酸生成の亢進は、部分的には水素栄養性アセト生成に起因する可能性があり、これが確認されれば、反芻動物がCH4生成と比較してより高い効率で宿主に対してH2とCO2を利用するための新しい代謝戦略となるだろう。デンプンが豊富な飼料はデンプン分解菌を強化し、中間体として乳酸を伴うアクリル酸経路を介してプロピオン酸の生産を強化し、健康な第一胃を維持し、メタン生成に利用できる H2 の生産を減少させます。デンプンの摂取量が多いと、メタン生成菌の存在量が減少して発酵が増加し、水素栄養呼吸に関与するヒドロゲナーゼの量が増加することに伴ってルーメンの dH2 濃度が増加しました。これらの発見は、対照的な発酵性を持つ炭水化物の給餌に基づく介入に適応する牛の第一胃微生物叢における独特の H2 代謝経路に関する新たな洞察を提供し、反芻動物におけるエネルギーハーベスティング戦略、健康な第一胃維持、および CH4 軽減を理解するのに役立ちます。第一胃内で H2 を利用するための代謝の柔軟性を備えた細菌の適応、回復力、定着、および宿主動物に対するそれらの利点を解明するには、さらなる研究が必要です。

すべてのデータは本文または補足資料で入手できます。第一胃微生物叢の 16S rRNA 遺伝子配列決定の生のリードは、国立バイオテクノロジー情報センター (NCBI、プロジェクト番号 PRJNA736529) で入手できます。第一胃微生物叢のメタゲノム配列決定の生の読み取りは、NCBI で入手できます (プロジェクト番号 PRJNA779163)。

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議論してくださった Zhi Peng Li 氏、Sheng Yong Mao 氏、Qiang Qiu 氏に感謝します。この研究は、中国国家自然科学財団 (助成金番号 31922080、32002204)、中国科学院の戦略的優先研究プログラム (助成金番号 XDA26040203)、中国湖南省科学技術計画 (2020NK2066、2022NK2021) によって支援されました。 MOF および MARA の農業研究システム、青少年イノベーション推進協会 CAS (助成金番号 Y202078)、中国科学院亜熱帯地域における農業生態学的プロセスの主要研究所の開放基金 (助成金番号 ISA2021203)。 CG は、NHMRC EL2 フェローシップ (APP1178715) によってサポートされています。

Qiu Shuang Li、Rong Wang などの著者も同様に貢献しました。

中国湖南省長沙、中国科学院亜熱帯農業研究所、亜熱帯地域における農業生態学的プロセスの重要研究室

Qiu Shuang Li、Rong Wang、Xiu Min Zhang、Jin Zhen Jiao、Zhi Liang Tan、Min Wang

中国科学院大学、北京、中国

Qiu Shuang Li、Zhi Liang Tan、Min Wang

蘭州大学牧畜科学技術学部、蘭州、中国

ジー・ユアン・マー

中国雲南省昆明、雲南大学生命科学部雲南生物資源保存利用国家重点実験室

張志剛

カリヤンカ地域研究センター、農業研究所 (INIA)、テムコ、チリ

エミリオ・M・ウンガーフェルド

湖南動物獣医学研究所、中国湖南省長沙

Kang Le Yi & Bai Zhong Zhang

中国湖南省花園市湖南省翔西牛工学技術センター

Kang Le Yi、Bai Zhong Zhang、Liang Long、Yun Long

湖南徳農畜産グループ有限公司、中国湖南省花園市

リャンロン＆ユンロン

Shanghai BIOZERON Biotechnology Company Ltd、中国、上海

イエタオ

中国科学院、上海栄養健康研究所、上海、中国

タオ・ファン

Biomedicine Discovery Institute、微生物学部、モナシュ大学、クレイトン、オーストラリア

クリス・グリーニング

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概念化と研究デザイン: MW、QSL。研究の実施とデータ収集: RW、QSL、ZGZ、YL。データ分析: QSL、RW、YT、TH、MW、JZJ、ZYM、CG。調査: KLY、BZZ、ZLT、LL、MW。執筆—原案：QSL、MW、ZGZ、ZLT、CG、EMU。執筆 - 査読および編集: すべての著者。

Zhi Liang Tan または Min Wang との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Li、QS、Wang、R.、Ma、ZY 他代謝的に異なる微生物を食事で選択すると、反芻動物の水素代謝が促進されます。 ISME J 16、2535–2546 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41396-022-01294-9

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受信日: 2022 年 2 月 2 日

改訂日: 2022 年 6 月 29 日

受理日: 2022 年 7 月 11 日

公開日: 2022 年 8 月 5 日

発行日：2022年11月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41396-022-01294-9

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