屋内または牧草地での乳用子牛の糞便および口腔マイクロバイオームに対するビタミン D3 補給の影響

Scientific Reports volume 13、記事番号: 9111 (2023) この記事を引用

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ビタミン D (VitD) は、代謝とミネラル恒常性における確立された役割に加えて、免疫調節剤としても浮上しています。この研究では、生体内で VitD がホルスタイン・フリージアン乳牛の口腔および糞便マイクロバイオームを調節するかどうかを判定することを目的としました。実験モデルは、代用乳に 6000 IU/Kg の VitD3 と飼料に 2000 IU/Kg を含む食餌を与えた 2 つの対照群 (Ctl-In、Ctl-Out) と、2 つの治療群 (VitD-In、Ctl-Out) で構成されました。 VitD-Out) 代替乳に 10,000 IU/Kg の VitD3、飼料に 4000 IU/Kg を配合。 1 つの対照群と 1 つの治療群は、約 10 週齢で離乳後に屋外に移動されました。 7 か月間の栄養補給後に唾液と糞便のサンプルが収集され、16S rRNA シーケンスを使用してマイクロバイオームの分析が行われました。ブレイ・カーティスの相違点分析により、サンプリング場所（口腔対糞便）と住居（屋内対屋外）の両方がマイクロバイオームの構成に重大な影響を与えることが特定されました。屋外で飼育された子牛は、屋内で飼育された子牛と比較して、Observed、Chao1、Shannon、Simpson、Fisher 測定に基づく糞便サンプル中の微生物の多様性がより高かった (P < 0.05)。糞便サンプル中のオシロスピラ属、ルミノコッカス属、CF231 属およびパルディバクター属については、住居と処理との間の有意な相互作用が観察されました。糞便サンプル中の VitD 補給後、Oscillospira 属と Dorea 属が増加しましたが、Clostridium 属と Blautia 属は減少しました (P < 0.05)。 VitD 補給と住居の間の相互作用は、口腔サンプル中の豊富な Actinobacillus 属と Streptococcus 属で検出されました。 VitD補給により、オシロスピラ属、ヘルコッカス属が増加し、アクチノバチルス属、ルミノコッカス属、モラクセラ属、クロストリジウム属、プレボテラ属、サクシニビブリオ属、およびパルビモナス属が減少しました。これらの予備データは、VitD 補給により口腔および糞便の両方のマイクロバイオームが変化することを示唆しています。今後、動物の健康と能力に対する微生物の変化の重要性を確立するために、さらなる研究が行われる予定です。

感染症は酪農システムの経済的持続可能性に重大な影響を及ぼし、年間の早期死亡率は平均して子牛のほぼ 10% を占める可能性があり、一部の農場企業ではその率が大幅に高くなります1。さらに、病気は、追加の子牛が生産目標を達成し、その遺伝的可能性を達成する能力を損ないます。若い乳用子牛が罹患する感染症の大部分は、呼吸器および腸内の細菌およびウイルス（呼吸器合胞体ウイルス、BVD、ヘルペスウイルス、大腸菌、ロタウイルス、サルモネラ菌）が原因です2,3。人生のスタートが不適応であると、牛の生産性が低下し続けるだけでなく、その後の人生で病気にかかりやすくなる可能性があります2。したがって、特に乳用子牛の福祉のニーズに適切に対応し、細菌感染症の治療法としての抗生物質への依存を減らすには、動物の自然な病気に対する抵抗力と健康を最適に強化するための継続的な努力が必要です。

子牛は、生後約 6 か月で免疫系の適応腕が徐々に発達して成熟するため、幼少期は病気から守るために主に先天性免疫系に依存しています4。最適な適応免疫システムのプライミングと恒常性の発達に大きく寄与するのは、マイクロバイオームの確立です。微生物の発生のための最初のスターター培養物は、出生直後に摂取された初乳に由来すると考えられていますが、より最近の研究では、ある程度の曝露が子宮内で起こる可能性があることが示唆されています5。新生児は乳のみを摂取しており、腸の定着は回腸で始まり、その後広範な発達中の反芻前管全体に定着すると考えられています6,7。腸内細菌叢の構成は若い子牛で確立されており、ファーミクテス属が優勢であることが報告されています。しかし、第一胃が発達し、組織の恒常性調節機構が発生するにつれて、微生物の連続においてかなりの動的な変化が発生します8。

多様なマイクロバイオームの確立をサポートすることは、現在、最適な免疫システムの発達とホメオスタシスの最適な確立を促進する上で重要な機能であると考えられています。実際、多様なマイクロバイオームは、侵入する病原体に対する主な防御機能であると考えられており9、マイクロバイオームの二極化または多様性の減少（腸内毒素症と呼ばれる）に寄与する要因は、重大な疾患リスク要因となっています。人間を対象とした最近の研究では、ビタミン D (VitD) の補給により腸内微生物の多様性が大幅に増加することが示されました。具体的には、バクテロイデス属とファーミクテス属の比率が増加し、健康を促進するプロバイオティクス分類群であるアッカーマンシア属とビフドバクテリウム属が豊富に存在しました10。口腔マイクロバイオームは、腸内マイクロバイオームほど研究の注目を集めてきませんでしたが、研究により、口腔マイクロバイオームにはナイセリア科、レンサ球菌科、パスツレラ科、さらにモラクセラ科を含む多くの科が同定されています11。しかし、これらの集団の相対的な存在量に対するVitDの影響は不明のままです。 VitD の補給は、若い乳牛の免疫系発達をサポートするメカニズムを提供する可能性がありますが、牛のマイクロバイオームの調節における VitD の役割はこれまで研究されていませんでした。

VitD は、ほとんどの哺乳類の生命維持に不可欠なステロイドです。 VitD の 2 つの最も顕著な形態は、エルゴカルシフェロール (Vit D2) とコレカルシフェロール (Vit D3) です。エルゴカルシフェロールは植物ステロイドであるエルゴステロールに由来するのに対し、コレカルシフェロールは太陽からの UVB 光線にさらされた後に皮膚で生成されます 12。牛は、皮膚合成および食事源（干し草、サイレージ、代用乳など）を通じて VitD を摂取できます。サイレージ中のビタミン D2 含有量は非常に変動しやすいことが多く、緑の草はビタミン D2 の供給源としては不十分です。したがって、草を食む反芻動物の場合、ほぼすべての VitD は皮膚の合成によって得られます。 Vit D3 は飼料濃縮物として提供されますが、飼育慣行の違いにより、農場間および年間を通じて牛の VitD 状態にばらつきが生じます13。

最近、私たちの研究により、春生まれの乳用子牛では VitD の循環レベルが最適以下であり 14、レベルの低下が免疫細胞集団やケモカイン、インターロイキンなどの免疫タンパク質の発現を含む全身免疫の重大な一時的変化と関連していることが証明されました。 815. したがって、我々は、この微量栄養素の補給により、ホルスタイン・フリージアン乳牛の口腔および糞便マイクロバイオームが大幅に変化するだろうと仮説を立てました。同じ VitD 補給モデルを利用して、この研究の目的は、食事による VitD 補給に応じて変化する可能性のある口腔および糞便中に存在する微生物集団を特徴付けることでした。

VitD の循環濃度は、マイクロバイオーム配列決定に使用されたグループ間で大きく異なりました (P < 0.05、図 1)。動物の成長や福祉に悪影響を与えないように、実験全体を通じてこれらのパラメーターを監視しました。病気の発生率に関して治療群間に有意差はありませんでした（P > 0.05）。 Ctl-Outグループは実験終了時に最終体重が低くなる傾向を示しましたが、初期体重または体重増加のいずれにも有意差は検出されませんでした（P > 0.05;補足図S1）。

各グループのホルスタイン・フリージアン子牛の血清中の循環濃度は 25OHD レベル。各グループ (n = 6) 内の子牛の血清 25OHD レベルの箱ひげ図および個々の子牛濃度 (ng/ml) を、統計的有意性を *p < 0.05 として示します。子ウシは、以前に発表された Flores-Villalva らによる大規模研究のサブセットでした14。

子牛の糞便と口腔のマイクロバイオームは、Permanova 分析と、Bray Curtis 距離行列と多次元スケーリングを使用した視覚化に基づいて、大きく異なりました (P < 0.05) (図 2)。アルファ多様性に関しては、観察、Chao1、およびシャノンの測定に基づいて、口腔サンプルと比較した場合、糞便サンプルはより多様でした (P < 0.05) (データは示さず)。組成の違いは、門レベルでの違いによってさらに強調されました（図3）。糞便マイクロバイオームでは、口腔マイクロバイオームと比較して、ファーミクテス属が有意に増加していましたが（94% 対 56%）、フソバクテリア（< 1% 対 9%）およびプロテオバクテリア（< 1% 対 23%）は減少していました。

多次元スケーリングとブレイ・カーティス距離行列に基づく主成分 (PC) 分析。この分析は、ホルスタイン・フリージアン子牛の糞便サンプルと口腔サンプルが明確に区別されていることを強調しています。 N = 1 グループあたり 22 頭の子牛。

治療と住居ごとにグループ化された門レベルでの糞便および口腔マイクロバイオームの構成。これらのデータは、ホルスタイン・フリージアン子牛の口腔微生物叢と糞便微生物叢の違いを示しています。 N = 1 グループあたり 4 ～ 6 頭の子牛。

糞便マイクロバイオームは、ルミノコッカス科（平均70％以上）が大半を占め、次いでラクノスピラ科（15％）、クロストリジウム科（3％）、ペプトストレプトコッカス科（2％）、リケネラ科（1％）が続き、残りの科は以下の割合で観察された。 1% (補足表 S1)。属レベルでは、オシロスピラ (平均 30%) が優勢な属で、フェカリバクテリウム (11%)、ドレア (10%)、ルミノコッカス (6%)、プレボテラ (5%)、CF231 (5%)、クロストリジウム (3%) が含まれていました。そして Blautia (2%) が顕著です (補足表 S1)。

VitD は、現在の研究ではアルファ多様性の測定に影響を与えませんでした (表 1)。しかし、住宅は、パーマノバ分析と、ブレイ・カーティス距離行列および多次元スケーリングを使用した視覚化に基づいて、糞便マイクロバイオームのベータ多様性に大きな影響を与えました（P < 0.05）（図4）。屋外で飼育された子牛は、屋内で飼育された子牛と比較して、Observed、Chao1、Shannon、Simpson、および Fisher 測定に基づく多様性がより大きかった (表 1; P < 0.05)。

多次元スケーリングとブレイ・カーティス距離行列に基づく主成分分析 (PCA)。この分析では、ホルスタイン・フリージアン種の子牛の糞便から採取したサンプルにおける、屋内飼育子牛と屋外飼育子牛の違いが示されています。 N = 1 グループあたり 12 頭の子牛。

糞便サンプル中の差異的存在量分析に対する重要な影響は表 2 に示され、完全な分析結果は補足表 S1 に示されています。門または家族レベルでの糞便マイクロバイオームに対する VitD 補給の有意な影響、または VitD 補給と住居の種類との相互作用はありませんでした (補足表 S1)。ペプトストレプトコッカス科、リケネラ科、およびルミノコッカス科は、屋外飼育された子牛では増加したが、屋内飼育された子牛では、ラクノスピラ科およびプレボテラ科が増加した（表２；Ｐ＜０．０５）。

ルミノコッカス属、CF231 パルディバクター属、およびオシロスピラ属では、飼育と治療の間に相互作用がありました (表 2; P < 0.05)。 VitD 補給によるルミノコッカス属の飼育と治療の間には相互作用があり、屋外でルミノコッカスが増加しましたが、屋内飼育された子牛では効果は確認されませんでした。 CF231 属の飼育と治療の間には相互作用があり、VitD 補給により屋内飼育では CF231 が増加しましたが、子牛が屋外にいる場合には、VitD 補給によりこの属が減少しました。パルディバクター属に対する飼育と治療の間には相互作用があり、屋内飼育の子牛では影響は認められなかったが、屋外でのVitD補給によりパルディバクター属が大幅に減少した。屋内飼育のオシロスピラ属の子牛では、ビタミンD補給が効果のなかった屋外飼育の子牛と比較して、VitD補給に対するより大きな反応が見られました。住宅タイプに関係なく、VitD 補給後、ドレア属は増加しましたが、クロストリジウム属とブラウティア属は減少しました (P < 0.05)。屋内で飼育された子牛では、屋外で飼育された子牛と比較して、フェカリバクテリウム、ブラウティア、プレボテラ、サクシニビブリオが増加していましたが、5-7N15 は減少していました（P < 0.05）。

口腔マイクロバイオームは、ルミノコッカス科（32%）、パスツレラ科（17%）、ラクノスピラ科（10%）、フソバクテリア科（6%）、レプトトリキア科（5%）、ナイセリア科（3%）、モラクセラ科（2%）、ペプトストレプトコッカス科（2%）で侵害されました。％）、クロストリジウム科（2％）、ティシエレラ科（2％）、フラボバクテリア科（2％）、マイコプラズマ科（2％）およびウィークセラー科（2％）（補足表S3に示されているデータの平均値）。属レベルでは、アクチノバチルス属（19％）、フソバクテリウム属（12％）、モラクセラ属（5％）、ルミノコッカス属（4％）、フェカルバクテリウム属（4％）、クロストリジウム属（4％）、オシロスピラ属（4％）の口腔マイクロバイオームが損なわれていました。、ドレア (3%)、オルニトバクテリウム (3%)、ヘロコッカス (2%)、およびブラウティア (1%) であり、他の属の存在量は 1% 未満と特定されています。

多様性の尺度は、口腔サンプルでは影響を受けませんでした（補足表S2）。口腔サンプルにおける差次存在量分析に対する重要な効果を表 3 に示し、完全な分析結果を補足表 S3 に示します。ファーミクテス門とプロテオバクテリア門の治療と住居の間には相互作用があった(P < 0.05)。 VitD の補給により、屋内飼育の子牛ではファーミクテスが減少しましたが、子牛が屋外にいた場合にはファーミクテスが増加しました。 VitD補給によるプロテオバクテリア門の治療と住居との間に相互作用があり、屋内ではプロテオバクテリアが増加しましたが、屋外では影響は確認されませんでした。 VitD を補給された子牛では、追加の VitD を与えられなかった子牛と比較してバクテロイデス属が増加しました (P < 0.05)。屋外で飼育された子牛では、屋内で飼育された子牛と比較して、フソバクテリア門と放線菌門が減少したが、テネリクテス属とシアノバクテリアが増加した(表3)。

パスツレラ科、ラクノスピラ科、レンサ球菌科およびナイセリア科では、治療と住居の間に相互作用があった（表 3）。屋内での VitD 補給は、屋外の子牛よりもパスツレラ科を大幅に増加させました。屋内での VitD 補給はラクノスピラ科を減少させましたが、屋外では影響は確認されませんでした。 VitD の補給と連鎖球菌科の飼育環境の間には相互作用があり、屋内飼育の子牛では増加し、屋外飼育の子牛では減少しました。 VitD の補給により、屋外の子牛ではナイセリア科が減少しましたが、子牛が屋内にいる場合にはこの属は影響を受けませんでした。 VitD の補給によりフラボバクテリア科が増加しましたが、VitD を摂取しなかった子牛ではレプトトリキア科とモラクセラ科が減少しました (P < 0.05; 表 3)。屋外飼育の子牛と屋内飼育の子牛を比較すると、VitD 屋外群の子牛と比較すると、レプトトリキア科、フソバクテリア科、ウィークセル科、コリネバクテリア科が屋内飼育子牛で高かったのに対し、マイコプラズマ科は減少しました（P < 0.05; 表 3）。

VitD の補給と、アクチノバチルス属、ストレプトコッカス属、およびドレア属の豊富な住居との間には相互作用がありました (P < 0.05; 表 3)。屋内での栄養補給により、子牛が屋外にいた場合よりも放線桿菌が大幅に増加しました（P < 0.05）。 VitD 補給と連鎖球菌属の飼育環境との相互作用から、屋内飼育環境では補給により連鎖球菌が増加する一方、子牛が屋外にいる場合には影響がなかったことが示されました。ドレアの場合、VitD 補給により屋内ではこの属が減少しましたが、屋外の子牛では増加しました (P < 0.05)。 VitD 補給により、ルミノコッカス属、モラクセラ属、サクシニビブリオ属、プレボテラ属、クロストリジウム属が減少しましたが、フラボバクテリウム属は住宅の種類に関係なく増加しました (P < 0.05; 表 3)。屋外飼育子牛と屋内飼育子牛を比較すると、屋外飼育の子牛ではモラクセラ菌、フラボバクテリウム菌、スフィンゴモナス菌、オシロスピラ菌が多かった一方、屋内飼育の子牛ではレンサ球菌、フソバクテリウム菌、ルミノコッカス菌、オルニトバクテリウム菌が多かった(P < 0.05; 表 3)。

25OHD 血中濃度と免疫機能の間の重要な関連性を特定する研究により、適切な VitD は最適な健康状態に不可欠であると考えられています。 VitD は、感染に対する反応を強化する自然免疫系の活性化因子として機能します。 VitD は、抗菌タンパク質の発現を促進し、細胞内イオン濃度を低下させ、オートファジーを強化することにより、病原体に対する生来の細胞の殺菌能力を刺激します 16,17。我々は最近、外因性 VitD が子牛の末梢血細胞におけるマイコバクテリアの死滅をどのように促進するかを示しました 18。さらに、VitD は適応免疫系の活性を調節し、その効果は一般に Th1 応答の阻害および Th2 細胞分化の促進として説明されます。したがって、VitD は過剰な炎症反応の発生を制限します 19。春生まれの乳用子牛の循環 VitD レベルは出生時には欠乏しており、生後約 5 か月までは最適状態にありません 14,20。子牛のマイクロバイオームと宿主の健康との関連性がますます確立されつつあり21、免疫機能とマイクロバイオームの間には本質的な関連性があるため、子牛のマイクロバイオームに対するVitD補給の影響についてはさらなる研究が必要です。私たちのこれまでの研究は、マイクロバイオームの加齢に伴う発達の特徴付けにおける重要なベースラインを形成し、今回我々は、VitD 補給に関連する多様性と組成変化を特定しました。 VitD とマイクロバイオームの関連性は、最近の複数の研究の主題となっています (Tangestani らによる総説 22)。効果のメカニズムは進行中の分析の対象ですが、VitD が腸内の宿主防御ペプチドの発現を上方制御し、腸組織で広く発現している VDR の調節を介して密着結合タンパク質の発現を変化させる可能性が示唆されています 10。したがって、この研究の目的は、2 つの異なる住宅条件にわたる食事による VitD 補給に応じて変化する可能性のある口腔および糞便中に存在する微生物集団を特徴付けることでした。

この研究では、ファーミクテス属が糞便マイクロバイオームの90%以上を占め、口腔マイクロバイオームは約55%のファーミクテス属、約20%のプロテオバクテリア、約10%のフソバクテリア、約5%のバクテロイデス属で構成されていました。これは、ファーミクテス属が子牛の糞便サンプル中の主要な門であるという以前の発見と部分的に一致しました8,11。 Klein-Jöbstl らの研究 23 では、Ruminococcaceae が牛の糞便微生物叢の主要な科であり、これは現在の研究と一致しています。しかし、Bardenらの研究11では、口腔サンプルではプロテオバクテリアが最も豊富な門であったのに対し、ここではファーミクテス属が最も豊富でした。パスツレラ科およびモラクセラ科を含む科も子牛の口腔サンプル中に非常に豊富に含まれているため、現在のデータセットと以前の研究の間には類似点も存在します11。 Owens らの研究では 24、プロテオバクテリアが口腔マイクロバイオームで優勢であるのに対し、子牛の糞便マイクロバイオームではバクテロイデスが優勢でした。子牛の年齢は、生後 28 日 11 から生後 60 日 24 までさまざまなサンプリングを行った文献の報告と、子牛が生後 230 日であった現在の研究との間の相違に寄与する重要な要因である可能性があります。

糞便マイクロバイオームに対する VitD に関連する興味深い変化がいくつかあり、特に住宅タイプによって異なる影響が見られました。オシロスピラ属の VitD 補給に対して、屋外飼育の子牛では効果がなかった場合と比較して、屋内飼育の子牛ではより大きな反応が見られました。ルミノコッカスに関しては逆の傾向が確認され、子牛が屋外にいて屋内に飼育されていない場合には、VitD 補給により効果が見られました。オシロスピラは植物の細胞壁を分解し、新鮮な飼料を与えると増加します25、26、27。以前、オシロスピラは、屋内にいる去勢牛と比較して、牧草地を放牧している去勢牛に多く生息していることが示されていました27。食餌が牧草地から屋内給餌に変更されると、オシロスピラの量は減少し、牧草地での放牧との明確な関連性が強調されました27。これは、おそらく提供される飼料の違いに関連している可能性が高いマイクロバイオームに関連した、屋内飼育子牛と屋外飼育子牛の違いを説明します。ルミノコッカスの場合、この属は屋内では影響を受けませんでしたが、VitD 補給後に屋外では 6% 以上増加しました。ルミノコッカスはオシロスピラと同様の機能を持ち、飼料の分解に関与します。ファーミクテス門およびラクノスピラ科では、住宅タイプに関係なくドレアが増加し、ブラウティアが減少しました。ドレアはセルロースとヘミセルロースの分解に活性があり、新生児の反芻動物の腸の健康を改善し、ADG を増加させると考えられています28、29、30。ブラウティアは、デンプン発酵後のプロピオン酸生成と相関しており、子牛の ADG の改善とも関連しています 31,32。 VitD 補給後、クロストリジウム属も減少しました。クロストリジウム属には、子牛に病気を引き起こす種、特に C.perfringens と C.difficile が含まれています33。これらの変化は、VitD 補給後の腸内マイクロバイオームに対する全体的なプラスの影響を示唆しています。

この研究では分類学的差異がVitD補給に関連しているが、VitDとマイクロバイオームの間の相互作用の理由はまだ不明である。まだ完全には確認されていませんが、この研究におけるマイクロバイオームへの影響は直接的な影響ではなく、むしろ微量栄養素の吸収後の作用によるものであるようです。以前の研究では、VitD は第一胃内で分解が検出されずに安定しており、小腸で吸収されることが以前に確立されていました 34。さらに、VitD は牛の in vitro 研究ではルーメン発酵パラメーターに影響を与えませんでした 35。これは、マイクロバイオームに対する VitD の影響が、おそらく腸上皮でのマイクロバイオームと宿主の間の相互作用を通じて、宿主の改変を通じて発生している可能性があることを示唆しています。宿主、特に宿主免疫に対する VitD のこの影響は、同じグループの子牛に対して行われた研究で強調されました 14。屋内で VitD3 を補給された子牛は、対照給餌子牛と比較して循環好中球、好酸球、好塩基球が減少しました 14。これまでに、ローズブリア属とオシロスピラ属の両方が宿主の免疫と代謝を調節する SNP に関連しており、この研究での VitD がマイクロバイオームに影響を与える可能性のある経路と関連していることから、宿主の遺伝学が反芻動物のマイクロバイオームに影響を与えることが確立されてきました 36。この研究では、子牛は屋内の牧草サイレージで飼育されるか、屋外の牧草地で飼育されました。畜産慣行が VitD 代謝に影響を与えることが知られているため、これは VitD の影響の違いを説明できる可能性があります 37。実際、ヒトとマウスの研究では、VitD とマイクロバイオームの間に関連性が示されています 38,39。興味深いことに、今回の研究では、1,25(OH)2D340を産生できないマウスと比較して野生型の割合が高かった2つの科（ルミノコッカス科とラクノスピラ科）もVitDの影響を受けました。この関連性をよりよく理解するには、特に便サンプルを代用として使用するのではなく、消化管のさまざまな領域から直接サンプリングすることによって、さらなる研究を行う必要があります。

口腔サンプルでは、プロテオバクテリア門内で、VitD の補給とアクチノバチルス属の飼育の間に相互作用があり、VitD はこの分類群を屋内では 15% 増加させましたが、屋外では 6% しか増加しませんでした。同じ門では、住宅に関係なく、VitD 補給後にモラクセラ菌とサクシニビブリオ菌が減少しました。いくつかの種の放線桿菌は、放線桿菌症（木の舌）という病気の原因と関連しているため、VitD 補給後のこの分類群の増加は、VitD と動物の健康の改善との関連性を考えると驚くべきことです。対照的に、モラクセラ属とサクシニビブリオ属は、VitD 補給後に減少しました。モラクセラは、モラクセラボビスを介した眼感染症に関連しています41。ファーミクテス門とクロストリジウム目には、VitD の影響を受ける属がいくつかありました。ドレア属の飼育環境と VitD の間には相互作用があり、屋内飼育の子牛では減少したが、屋外では増加しました。これは、サプリメントが屋内と屋外の両方でドレア属を増加させた糞便で見られる効果とは異なります。有益と考えられる効果の 1 つは、VitD 補給後に減少したクロストリジウム属の減少です。クロストリジウム属は、子牛に病気を引き起こす多くの種、特に C.perfringens と C.difficile を含むことが知られている属です 33。興味深いことに、糞便サンプル中のクロストリジウムも減少しました。しかし、クロストリジウム属の減少とは対照的に、VitD の補給により連鎖球菌属が増加しました。連鎖球菌は、Streptococcus bovis42 などの多くの病原性細菌を含むことが知られている属であるため、VitD がこの属を増加させているという事実は、やはり驚くべきことです。これらの特定された変化がふくらはぎに与える影響を調べるために、さらなる研究を行う必要があります。

この研究の主な目的は、2 つの異なる飼育タイプ (屋内と屋外) における VitD 補給の影響を評価することですが、補給に関係なく、屋内および屋外で給餌された子牛のマイクロバイオームを比較することも興味深いです。ベータ多様性分析は、サンプルタイプ間の組成の相違を決定するために使用され、糞便サンプルでは住居タイプ間の明確な違いが示されましたが、口腔サンプルでは違いが見られませんでした。実際、屋内で飼育されている子牛と屋外で飼育されている子牛とでこの違いを引き起こしている可能性のある要因は数多くあり、それらがマイクロバイオームに影響を与えている可能性があります。屋内群と屋外群は、約 70 日目の離乳まで同様に管理されました。この時点の後、屋内グループは屋内に留まり、牧草サイレージと干し草を自由に与えられましたが、他のグループは屋外に移動され、放牧された草が与えられました。これらの食事の違いが、特定されたマイクロバイオームの変化の主要な要因である可能性があります。アルファ多様性の違いは、糞便サンプルで確認され、屋外で飼育された子牛では、調べた多様性のすべての尺度に基づいて多様性が増加していましたが、口腔サンプルでは違いはありませんでした。興味深いことに、これは分類群の豊富さ、分類群の豊富さ、均一性の大幅な変化を示しています。細菌の多様性の増加は、環境の影響に対する堅牢性の向上 43 と腸の健康の改善 44 に関連しています。住宅の影響がこの研究の主な焦点ではなかったため、マイクロバイオームに影響を与えている可能性のある食事や環境など、管理されていない要因がいくつかありますが、住宅の種類がマイクロバイオームに与える影響を確立するには、今後のより詳細な研究が必要です。子牛のマイクロバイオーム。さらに、各グループの子牛の最終体重は、この差は有意ではありませんが、Ctl-Out 子牛の体重が低いことを示唆しています。 VitD の補給がより大きな子牛コホートにおける子牛の成長をサポートするかどうかを調べる将来の研究に関連するでしょう。

新生児の死亡率と罹患率は乳業業界にとって依然として重大な問題であり3、負の福祉と抗生物質に依存した慣行を減らすために管理システムを適応させる必要があります。最適な免疫システムの発達をサポートする栄養戦略は、特に集中的に飼育された乳用子牛において、これらの損失を軽減する大きな可能性を秘めています。 VitD3 皮膚合成を調節する要因としては、緯度、高度、太陽光にさらされる時間など、複数の要因が知られています 45。ここで、この予備分析は、VitD の補給により子牛のマイクロバイオームが大きく変化することを示唆しています。 VitD の抗菌および免疫調節の役割は、子牛の免疫機能を高めるための低コストで効果的なサプリメントを提供する可能性があり 46、この研究における口腔および糞便のマイクロバイオームへの影響は、発酵、栄養素の消化率、および健康に関するさらなる研究のための興味深い領域を提供します。微生物集団におけるこうした変化は、乳牛の病気に対する回復力を高めるのに役立つ可能性があります。

この研究で使用された動物は、Flores-Villalva らによって記載された研究の一部であり 14、以下に簡単に説明します。 2020年2月から3月の間に生まれた、単一農場からの平均体重42kgのホルスタイン・フリージアン種雄牛48頭が実験に登録された。実験は、2×2の階乗配置によるランダム化された完全ブロック計画で、子牛は4つの治療のうちの1つにランダムに割り当てられました（n = 12）。治療は、2 つのビタミン D3 食餌 (Ctl と VitD) および 2 つの日光アクセス条件 (屋内 = 屋内、または屋外 = 屋外) を用いた要因計画として配置されました。 6000 IU/kg の VitD3 を含む市販の乳代替品 (MR) と 2000 IU/kg の VitD3 を含む市販のペレットを Ctl 食に使用しました。 VitD3 食餌の場合、MR とペレットに VitD3 を補充して、それぞれ 10,000 IU/kg と 4000 IU/kg の VitD3 を達成しました。したがって、それぞれ 12 頭の子牛に対する 4 つの処理は次のとおりでした。 Ctl-In: 屋内および MR で 6000 IU/Kg + 飼料で VitD3 2000 IU/Kg。 VitD-In: 屋内および MR で 10,000 IU/Kg + 飼料で 4000 IU/Kg の VitD3。 Ctl-Out: 屋外および MR で 6000 IU/Kg + 飼料で 2000 IU/Kg の VitD3。 VitD-Out: 屋外および MR で 10,000 IU/Kg + 飼料で 4000 IU/Kg の VitD3。代替乳は離乳まで与えられ、その後は飼料のみで栄養補給が行われました。市販の代用乳と市販のペレットの両方の組成分析は補足データで提供されます。離乳後の治療は、試験終了時の70日目から230日目まで行われた。子牛の体重を実験の開始時に測定し、その後、70日目、130日目、160日目、および230日目に測定した。実験の開始時に、エタノールを含むビヒクル注射を受けたCtl-Inを除くすべての子牛に、50,000 IUのVitD3の単回注射を皮下投与した。ＶｉｔＤ３は、１グラム当たり５００，０００ＩＵのＶｉｔＤ３を含有する乾燥粉末濃縮物（ＲｏｖｉｍｉｘＤ３５００、ＤＳＭＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｌＰｒｏｄｕｃｔｓ）から、０．５ｇの濃縮物を蒸留水に添加することによって調製した。サプリメントは毎週新たに調製し、4 °C で保存しました。サプリメントを 1 日 1 回 MR に追加し、離乳後にペレットにトップドレッシングを与えました。

すべての子牛は、アイルランド、ミース州の Teagasc Animal and Bioscience Research Centre で集団飼育されました。 70 日で離乳した後、平均的な屋外グループ (Ctl-Out、VitD-Out) を放牧地に移動し、5 月から 10 月まで交代で放牧しました。屋内群（Ctl-In、VitD-In）は試験期間中監禁され、干し草とサイレージが自由に与えられました。 25OHD 血清濃度の分析は、以前の研究の一部として行われました 14。実験の過程で、呼吸器疾患または胃腸疾患の兆候が記録されました。ただし、グループ間の差異は観察されませんでした。子牛1頭が失われたが、実験的治療とは無関係だった。各子牛の体重は出生時と試験終了時に記録され、補足図S1に示されています。

VitD3 の補給と住居の種類がマイクロバイオームに及ぼす影響を調べるために、治療群あたり 6 頭の子牛から 230 日間の補給後に口の頬側領域と直腸からスワブを採取しました。スワブを口または直腸に挿入し、時計回りに 3 回回転させ、PBS 緩衝液を含むチューブに保管し、ドライアイスに移しました。次に、分析まで綿棒を -80 °C で保管しました。

糞便および口腔スワブからの細菌 DNA の抽出と、その後の細菌 16S rRNA 遺伝子の V3 ～ V4 超可変領域のハイスループットシーケンスは、Illumina MiSeq プラットフォームで標準プロトコールに従って実行されました (Eurofins Genomics、Ebersberg、ドイツ)そして前述したように47。 V3-V4領域は、フォワードインデックスプライマーおよびリバースインデックスプライマーのヌクレオチド配列を含むアダプターを取り込んだユニバーサルプライマーを使用してPCR増幅されました。アンプリコン精製は、AMPure XP ビーズ (Beckman Coulter、米国インディアナ州インディアナポリス) を使用して実施し、Nextera XT インデックスプライマー (Illumina、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国) を使用してインデックス PCR 用に準備しました。 AMPure XP ビーズを使用してインデックス付きサンプルで精製ステップを繰り返し、フラグメント分析装置 (Agilent、サンタクララ、カリフォルニア州、米国) を使用して評価しました。このステップに続いて、各実験サンプルから等量を使用してプールを作成しました。次に、Bioanalyzer 7500 DNA キット (Agilent) を使用してライブラリーを分析し、V3-V4 ケミストリー (2 × 300 bp ペアエンドリード) を使用して配列決定しました。

Quantitative Insights into Microbial Ecology (Qiime) を使用して配列データを調べました 49。 Cutadapt パッケージを使用してシーケンシングプライマーを削除し、標準基準を使用して Qiime 内のペアエンドリード機能を使用して、結果として得られたペアエンドリードをマージしました。ペアエンドの生読み取りの逆多重化は分割ライブラリ機能を通じて行われ、品質フィルタリングはデフォルトの QIIME パラメータを利用して実行されました。あいまいな文字を含まず、バーコードが完全に一致しない、配列長が 225 ヌクレオチドを超え、読み取り品質スコアが 27 を超えるリードのみが保持されました。 Qiime の uclust 関数を使用して、97% の配列類似性に基づいて OTU を選択しました。 ChimeraSlayer50、51 を使用してキメラ配列が削除される一方で、複数のサンプルで少なくとも 2 つのリードのレベルで存在する OTU のみが保持されるため、シングルトンは削除されました。 GreenGenes データベースは、OTU をさまざまな分類レベルに割り当てました。正規化された OTU テーブル、実験表現型データ、および系統樹の組み合わせを組み合わせて、さらなる分析のために phyloseq オブジェクトを作成しました (http://www.r-project.org、バージョン 3.5.0、3 月 25 日にアクセス)。微生物叢の豊かさと多様性のダイナミクスは、観察された Chao1、Shannon、Simpson、Fisher 指数を使用して計算されました。多様性のシンプソン指数とシャノン指数は、豊かさと均一性パラメーターの両方を説明します。ベータ多様性測定値は、他のすべてのサンプルと比較した、1 つのサンプルにおける OTU の系統構造の分離の尺度です。これは、分類学的特徴数がサンプル間で比較できるようにデータを正規化することによって推定されました。さまざまな多次元削減法の距離行列を計算するために、いくつかの距離メトリックが考慮されました。これらには、R52,53 の phyloseq を使用した加重/重み付けされていない UniFrac 距離および非系統発生的距離メトリック (つまり、Bray-Curtis、Jensen-Shannon 発散、およびユークリッド) が含まれていました。差次存在量テストは、門、科、属レベルで phyloseq オブジェクトから抽出されたテーブルに対して実行されました。データは、統計分析ソフトウェア (SAS) 9.4 (SAS、2013) 内の PROC Glimmix 手順を使用して分析されました。このモデルは、治療（Ctrl vs. VitD）および飼育（屋内 vs. 屋外）の主な効果と、実験単位である個々の子牛との関連する相互作用を評価しました。相対的な細菌存在量の統計分析には、治療グループあたり 6 頭の子牛を使用しました。ただし、口腔サンプル中の VitD-In グループは例外で、スワブ内の DNA が不十分だったため 4 サンプルしか含まれていませんでした。結果は、Benjamini-Hochberg (BH) で調整された P 値を使用して表示されます。

すべての実験手順は Teagasc 倫理委員会 (TAEC237-2019) によって承認され、動物虐待法 (アイルランド 1876 年) および欧州共同体指令に従って、健康製品規制当局からの実験ライセンス (AE19132/P105) に基づいて実施されました。 2010/63/EU。原稿での報告は、ARRIVE ガイドラインの推奨事項に従っています。

16S rRNA 遺伝子配列データは、研究受託番号 PRJEB56677 で欧州ヌクレオチドアーカイブ (ENA) に寄託されました。

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リファレンスをダウンロードする

この研究の資金は、アイルランド科学財団の助成金を通じて Kieran Meade (17/CDA/4717) に提供されました。 SFV はまた、博士課程奨学金の提供に対して Conacyt Mexico に謝意を表します。

アイルランド、ダブリン 4、ベルフィールド、ユニバーシティカレッジダブリン、農業食品科学学部

S. ヴィガーズ、S. フローレスビジャルバ、KG ミード

CENID 生理学、INIFAP、ケレタロ、メキシコ

S. フローレスビジャルバ

Conway Institute of Biomolecular and Biomedical Research、University College Dublin、ベルフィールド、ダブリン 4、アイルランド

KGミード

Institute of Food and Health、University College Dublin、ベルフィールド、ダブリン 4、アイルランド

S. ヴィガーズ & KG ミード

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研究の着想と設計、実験の設計: SFV、SV、KM 実験の実行: SFV、SV データ解析: SV 論文の執筆と編集: SFV、SV、KM 結果の解釈: 著者全員。著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

KGミードへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Vigors, S.、Flores-Villalva, S.、Meade, KG 屋内または牧草地での乳用子牛の糞便および口腔マイクロバイオームに対するビタミン D3 補給の影響。 Sci Rep 13、9111 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-34840-2

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受信日: 2022 年 10 月 19 日

受理日: 2023 年 5 月 9 日

公開日: 2023 年 6 月 5 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34840-2

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