食事による鉄過剰は西洋食による肝炎症を促進し、ラットの脂質代謝を変化させるが、これはヒトDIOSと類似している

Scientific Reports volume 12、記事番号: 21414 (2022) この記事を引用

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肝臓の鉄過剰は、多くの場合、非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）を伴います。 代謝異常鉄過剰症候群（DIOS）は、肝臓と体内の鉄貯蔵量とメタボリックシンドローム成分の増加を特徴とします。 鉄過剰を伴うNAFLDとDIOSとの重複を示唆する証拠が増えている。 しかし、鉄がその発病にどのように関与するのかというメカニズムは依然として不明である。 今回我々は、鉄過剰症のNAFLDラットモデルの病理における鉄の役割を調査した。 西洋食（高脂肪および高フルクトース）を26週間与えたラットは、体重増加および脂質異常症を伴う脂肪肝を示した。 西洋型食餌に鉄過剰摂取を加えると、血清トリグリセリドとコレステロールがさらに増加し​​、肝臓の炎症が悪化した。 罹患した肝臓では、NFκB の核移行および Th1/M1 関連サイトカインの上方制御に関連して、類洞マクロファージ/クッパー細胞に強い鉄沈着が見られました。 このモデルは、NAFLD および DIOS の発症と進行の根底にあるメカニズムを調査し、「多重ヒット」因子の 1 つとしての鉄の重要な役割を解明するのに役立つであろう。

非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）は、今日世界中で慢性肝疾患の最も一般的な原因となっています。 これは、肥満、2 型糖尿病 (T2DM)、脂質異常症、高血圧などのメタボリックシンドローム (MetS) と強く関連しています。 世界人口における NAFLD の有病率は 25% と推定されており、MetS 患者数の増加により過去 10 年間一貫して増加しています 1,2。 ほとんどの患者は肝細胞損傷や炎症が最小限で肝トリグリセリドが蓄積している状態（単純性脂肪肝または非アルコール性脂肪肝[NAFL]）ですが、一部の患者ではより多くの肝細胞損傷や炎症を伴う肝臓トリグリセリド蓄積（非アルコール性脂肪性肝炎、NASH）があり、進行する可能性があります。肝線維症/肝硬変、そして最後には肝細胞癌 (HCC) に至るまで。 疫学研究では、生検を受けた NAFLD 患者と非生検 NAFLD 患者の NASH 有病率はそれぞれ 59% と 6.7 ～ 30% であり、そのうち 0.5% が HCC1 に進行すると推定されています。

集中的な努力により、病状を改善するいくつかの NAFLD 治療薬が発見されましたが、依然として解決されていない課題がほとんど残っています 3。 この困難の主な理由の 1 つは、NAFLD の進行の根底にある病因が非常に複雑で多因子であることです。 「多重ヒット」仮説は、さまざまな病因（例、インスリン抵抗性、脂肪毒性、酸化ストレス、免疫の変化、腸内細菌叢異常）が病気の発症と進行中に並行して相乗的に作用しているというものであり、理解のために広く受け入れられています。 NAFLD4,5の病因。 したがって、ヒト NAFLD の全範囲を表す前臨床動物モデルの確立は非常に困難ですが、NAFLD の効果的な治療法の開発には強く必要とされています6,7。

鉄は、酸素輸送、ミトコンドリア呼吸、核 DNA 合成、細胞シグナル伝達などの重要な生物学的プロセスに必要であるため、体にとって必須の微量栄養素です 8,9。 過剰な鉄は肝臓、心臓、内分泌腺などの特定の臓器に蓄積し、フェントン反応による活性酸素種の生成により組織損傷を引き起こします9。 不適切に低い血清ヘプシジンレベルと高フェリチン血症として現れる鉄調節異常は慢性肝疾患によく見られますが、肥満と糖尿病の両方がヘプシジン産生を増加させると考えられているため、NAFLDでは高レベルの血清および肝臓ヘプシジンが報告されています10,11。 肝臓の鉄蓄積は NAFLD 患者の 30 ～ 35% に存在し、いくつかの疫学研究では体内の鉄貯蔵量の増加と MetS、NAFLD、およびインスリン抵抗性との関連が示唆されています 12、13、14。 さらに、他の研究では、肝臓の鉄沈着の存在とパターンが、NAFLD における進行性肝線維症、肝細胞傷害、脂肪性肝炎と関連していることが示唆されています 12,15,16。

代謝異常鉄過剰症候群（DIOS）は、鉄過剰の原因が特定できないにもかかわらず、MetS のさまざまな成分に関連する体内の鉄貯蔵量の増加によって定義される状態です。 臨床的には、高フェリチン血症、正常または中等度のトランスフェリン飽和度の増加、および MetS 成分の存在によって診断されます 17、18、19、20、21。 DIOS と NAFLD は強い相関があると考えられています。 DIOS 患者の約 50% が NAFLD を患っており、NAFLD 患者の 30% 以上が DIOS を患っています18,21。

NAFLD、鉄過剰症、MetS との関連性を示唆する新たな証拠が示されているが、鉄がこれらの代謝性疾患の進行をどのように促進するのかというメカニズムは依然として不明である 18。 ヒト NAFLD の肝臓および全身状態を表す鉄過剰の動物モデルを適用できれば、代謝疾患に対する鉄の影響を理解できるようになります。 我々は以前、NAFLD22のラットモデルにおいて、食事による鉄補給による炎症誘発性サイトカインの上方制御に伴う肝炎症の増加を示した。 ただし、以前のモデルでは肝臓に軽度の鉄が蓄積するだけでした。 NAFLD と DIOS の間の架橋を調査するには不十分です。 私たちの知る限り、鉄過剰を伴う NAFLD と DIOS の両方の臨床的および病理学的表現型を表す確立されたモデルはありません。 したがって、この研究は、NAFLDの発症における鉄過剰の病理学的役割を明らかにすることを目的としており、鉄過剰が「多重ヒット」因子の1つとして疾患に影響を与えるかどうか、またどのように影響するかに焦点を当て、長期にわたる新しい動物モデルを使用しています。鉄分を補給しながら西洋食を与えます。

西洋食（WD）および西洋食+高鉄食（WD + Fe）グループのラットは、それぞれ対照（Cont）グループおよび高鉄食（Fe）グループと比較して、カロリー摂取量の増加に基づいて体重の増加を示しました（図1b、c)。 高鉄食（Fe）群のラットは、食物消費量とカロリー摂取量が多いにもかかわらず、Cont群よりも体重が低かった（図1a〜c）。 高鉄食を与えられたげっ歯類の食欲の増加は、脂肪細胞における cAMP 応答性エレメント結合タンパク質 (CREB) 依存性のレプチンの下方制御と関連していることが示されています 23。 Fe 群の体重の減少は、鉄過剰が骨格筋および肝臓における AMP 活性化プロテインキナーゼ活性のアップレギュレーションによって有益な代謝効果をもたらすという以前の発見によって説明できます 24。Cont および Fe 群の肝臓は、全体的には正常な外観を示しました。 。 一方、WD および WD + Fe グループの肝臓には、びまん性の変色を伴う肝腫大があり (図 1d)、脂肪肝を示唆していました。 肝臓の絶対重量と相対重量の両方が、Cont および Fe グループと比較して WD および WD + Fe グループで増加しました (絶対肝臓重量; WD 対 Cont では P = 0.0055、WD + Fe 対 Cont では P < 0.0001、WD では P = 0.0049) vs. FeおよびP < 0.0001（WD + Fe vs. Fe、相対肝臓重量）; P = 0.0003（WD vs. Cont）、P < 0.0001（WD + Fe vs. Cont）、P = 0.006（WD vs. FeおよびP <） WD + Fe 対 Fe の場合は 0.0001); それらはWDグループよりもWD + Feの方が高かった（絶対肝臓重量; P = 0.0174、相対肝臓重量; P = 0.0025）（図1e、f）。 組織学的に、Cont グループと Fe グループの肝臓には検出可能な異常はありませんでした (図 2a、d、e、h)。 散在する大小胞性脂肪症を伴うびまん性微小胞性脂肪症がWDおよびWD + Feグループで観察され、その程度は2つのグループ間で同様でした（図2b、c、f、g）。 WD および WD + Fe グループの肝細胞の脂質空胞は、オイルレッド O で赤く染色されました（図 2i-l）。 組織学的脂肪症と一致して、肝トリグリセリド含量は、WD 群 (P < 0.0001 vs. Cont、P = 0.0001 vs. Fe) および WD + Fe 群 (P = 0.0012 vs. Cont、P = 0.0016 vs. Fe) で増加しました。 2 つのグループ間の有意差 (図 2m)。

対照群、WD、WD + Fe、および Fe 群の (a) 摂食量、(b) カロリー摂取量、および (c) 体重の時間的変化。 カロリー摂取量は、補足表 1 に示す各食事の推定総カロリーを食物消費量に乗じて計算しました。(d) 26 週目の対照、WD、WD + Fe、および Fe グループの肝臓の肉眼画像。バー: 1 cm。 （ e ）26週目の対照、WD、WD + FeおよびFeグループの体重100 gあたりの絶対肝臓重量および（ f ）相対肝臓重量。データは箱とひげとして表示されます（n = 4/グループ）。 *P < 0.05 対 Cont、†P < 0.05 対 WD、§P < 0.05 対 Fe (一元配置分散分析とそれに続く Tukey の多重比較による)。

26週目の(a)対照、(b)WD、(c)WD+Feおよび(d)Fe群の肝臓の組織病理学。CV:中心静脈。 バー：100μm。 (e – h) それぞれ、広告の倍率が高くなります。 バー：15μm。 26 週目の (i) コントロール、(j) WD、(k) WD + Fe、および (l) Fe グループの肝臓のオイルレッド O 染色切片。バー: 50 μm。 (m) 26週目の肝臓トリグリセリド含量。データは箱ひげとして示されている(n = 4/グループ)。 *一元配置分散分析とそれに続く Tukey の多重比較による Cont に対して P < 0.05、および Fe に対して §P < 0.05。

血清および肝臓の鉄は、Cont グループと比較して、Fe（血清鉄; P < 0.0001、肝臓鉄; P = 0.0071）およびWD + Feグループ（血清鉄; P = 0.0003、肝臓鉄; P = 0.0262）で増加しました（図3a） 、ｂ）全身鉄恒常性のマスター調節因子である肝臓ヘプシジンの上方制御（ＦｅおよびＷＤ＋Ｆｅ対ＣｏｎｔについてＰ＜０．０００１）と関連する（図３ｄ）。 血清鉄も、Cont グループと比較して WD グループで増加しました (P = 0.0025)。 鉄輸送体トランスフェリンの循環遊離鉄25への結合能力を示すトランスフェリン飽和度は、他の3グループと比較してFeグループで増加しました（P < 0.0001対Cont、WDおよびWD + Fe）（図3c）。 トランスフェリン飽和度は、血清鉄が増加したにもかかわらず、WD グループと WD + Fe グループで変化しませんでした。 トランスフェリン飽和度の増加を伴わない血清鉄の増加は、ヒト DIOS の臨床的特徴です 17,21。 ヒトの体内鉄貯蔵量のマーカーとして広く使用されている血清フェリチン 25 は、すべてのグループ間で大きな変化はありませんでした。 他の場所で説明されているように、肝臓の鉄貯蔵量とは相関していませんでした（補足図S1a、b）。 Perls の鉄染色により、Cont および WD グループと比較して、WD + Fe および Fe グループの類洞細胞および肝細胞における鉄の蓄積が明らかになりました（図 3g–j）。 鉄の蓄積は、Fe 群と WD + Fe 群の両方の肝細胞よりも類洞細胞でより強かった。 鉄染色と組み合わせた免疫組織化学は、鉄が主に類洞のIba1陽性マクロファージ/クッパー細胞に蓄積していることを示した(図3k、l)。 鉄の蓄積は酸化ストレスを誘発する可能性があるため、NAFLD 進行の重要な要因の 1 つとして関連付けられることがよくあります 27,28。 酸化ストレス（脂質過酸化）の一般的に使用されるバイオマーカーであるマロンジアルデヒド（MDA）の肝臓含有量28は、WD + Feグループで増加しました（P = 0.0403対WD）（図3e）、一方肝臓グルタチオン（GSH）/酸化ストレスと抗酸化物質のバランスの指標である酸化型グルタチオン（GSSG）比 29 は、大きく変化しませんでした（図 3f）。 これらの結果は、酸化ストレスは、少なくとも組織レベル全体において、このモデルにおける脂肪肝疾患の発症において主要な役割を果たしていないことを示唆した。

(a) 血清鉄、(b) 肝臓鉄含有量、(c) トランスフェリン飽和、および (d) 26 週目のヘプシジン mRNA の肝臓発現の血液生化学データ。(d) データは 18S rRNA に正規化され、倍率変化として表されました。コントロールグループから。 （e）チオバルビツール酸反応性物質法により測定した、26週目の肝臓のマロンジアルデヒド（MDA）含量。 （ f ）26週目のグルタチオン（GSH）/酸化グルタチオン（GSSG）の肝臓含有量の比。データは箱とひげとして示されています（n = 4/グループ）。 *P < 0.05 対 Cont、†P < 0.05 対 WD、§P < 0.05 対 Fe (一元配置分散分析とそれに続く Tukey の多重比較による)。 26週目の(g)コントロール、(h)WD、(i)WD+Feおよび(j)Feグループの肝臓におけるPerlsの鉄染色の画像。バー。 50μm。 26週目の（k）WD + Feおよび（l）FeグループにおけるPerlsの鉄染色と組み合わせたIba1のIHC。矢印は、Iba1陽性マクロファージ/クッパー細胞（茶色に染色）における鉄の蓄積（青色に染色）を示します。 バー; 30μm。

血清トリグリセリドはWD + Feグループでのみ増加しました（P = 0.0149 vs. Cont）（図4a）。 血清総コレステロールは、Cont および Fe 群と比較して、WD (P < 0.0001 vs. Cont および Fe) および WD + Fe (P < 0.0001 vs. Cont および Fe) グループで増加しました。 それはWDグループよりもWD + Feの方が高かった（P < 0.0001）（図4b）。 血清遊離脂肪酸、グルコース、およびインスリンは、すべてのグループ間で有意な差はありませんでした（図4c〜e）。 しかし、血清インスリン値は、WD + Fe グループの 4 匹のラットのうち 1 匹で非常に高かった (12,949 pg/mL 対 Cont グループでは 2107 ± 1698 pg/mL)。 血清アルカリホスファターゼ（ALP）は西洋食給餌によって増加しました（WD対Contの場合はP = 0.0185、WD対Feの場合はP = 0.0014、WD + Fe対Feの場合はP = 0.0093）（図4f）。 血清アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼとアラニンアミノトランスフェラーゼは、WDおよびWD + Feグループでは増加せず、Feグループでは減少しました（補足図S2a、b）。

26 週目の (a) 血清トリグリセリド、(b) 総コレステロール、(c) 遊離脂肪酸、(d) グルコース、(e) インスリン、および (f) アルカリホスファターゼ (ALP) の血液生化学データ。データは次のように表示されます。ボックスとウィスカー (n = 4/グループ)。 *P < 0.05 対 Cont、†P < 0.05 対 WD、§P < 0.05 対 Fe (一元配置分散分析とそれに続く Tukey の多重比較による)。

肝臓では、インスリンはチロシン残基でのインスリン受容体基質（IRS1/2）のリン酸化を促進します。 IRS1 が Tyr612 でリン酸化されると、糖新生の抑制などのインスリンの代謝機能を媒介します 30。 IRS1/2 のチロシンリン酸化後、Akt セリン/スレオニンプロテインキナーゼ、特に Akt2 はリン酸化によって活性化され、糖新生とグリコーゲン分解を制御する転写因子であるフォークヘッドボックスタンパク質 O1 (FOXO1) のリン酸化と核移行を抑制します 30,31 。 FOXO1 は、重要な肝糖新生遺伝子である Pck1 および G6pc の転写を直接刺激します 30,31。 インスリン抵抗性のある MetS 患者は、IRS1 のチロシンリン酸化が阻害され、Akt2 リン酸化の下方制御につながる可能性があると考えられています。 Akt2 活性化の抑制により FOXO1 が核内に留まり、その結果、肝臓の糖新生が持続的または過剰に活性化されます 32。 この研究では、総IRS1の肝臓発現はすべてのグループ間で有意な差はありませんでしたが（図5a）、IRS1（Tyr612）のチロシンリン酸化はWD（P = 0.0002 vs. ContおよびP < 0.0001 vs. Fe）およびWD +で減少しました。 Fe（P = 0.0002対ContおよびP = 0.0087対Fe）グループをContおよびFeグループと比較しました（図5b）。 総およびリン酸化 Akt2 の発現も、WD (総 Akt2; P = 0.0027 vs. Cont および P = 0.0259 vs. Fe、リン酸化 Akt2; P = 0.007 vs. Fe) および WD + Fe (総 Akt2; P = 0.0002 vs.) で減少しました。 Cont および P = 0.0013 vs. Fe、リン酸化 Akt2; P = 0.0272 vs. Cont および P = 0.0002 vs. Fe) (図 5c、d)。 FOXO1の核移行は4つのグループ間で有意な変化はありませんでした（図5e、f）。 さらに、Pck1およびG6pc遺伝子の肝臓発現は、WDおよびWD + Feグループで下方制御されました（補足図S3a、b）。 これらのデータは、WD および WD + Fe グループの肝臓ではインスリンシグナル経路が少なくとも部分的に変化していることを示唆しています。

26 週目における全肝臓組織溶解物からの (a) 総 IRS1、(b) ホスホ IRS1(Tyr 612)、(c) 総 Akt2、(d) ホスホ Akt2 の肝臓発現。 e) 26週目の細胞質および(f) 核画分。GAPDHおよびヒストンH2Bを、それぞれ全組織/細胞質および核画分におけるローディングコントロールとして使用した。 データは対照からの倍率変化として表され、箱ひげとして表されます (n = 4/グループ)。 *一元配置分散分析とそれに続く Tukey の多重比較による Cont に対して P < 0.05、および Fe に対して §P < 0.05。

組織病理学的検査により、WD（P = 0.0011 vs. Contおよび P = 0.0011 vs. Fe）およびWD + Fe（P < 0.0001 vs. ContおよびP）における肝小葉の炎症巣の数の増加が明らかになりました（図6a、b）。 < 0.0001 vs. Fe) グループ; この数値は、WD グループよりも WD + Fe の方がはるかに高かった (P < 0.0001)。 サイトカイン遺伝子の肝臓発現は、WD (IL1β; P = 0.0254 vs. Cont、IL10; P = 0.038 vs. Cont) および/または WD + Fe (TNFα; P = 0.0035 vs. Cont および P = 0.0028 vs. Fe、 IFNγ; P = 0.0001 vs. Contおよび P = 0.0001 vs. Fe、IL1β; P = 0.0047 vs. Cont、IL10; P = 0.0013 vs. ContおよびP = 0.0026 vs. Fe）グループ（図6c〜f）。 TNFαおよびIFNγの発現はWD+Fe群の方がWD群よりも高かった(TNFα; P = 0.0352、IFNγ; P = 0.0004)。 組織マクロファージは、機能的に古典的に活性化された M1 型 (炎症促進特性を持つ) と代替的に活性化される M2 型 (抗炎症特性または回復促進特性を持つ) に分類されます 33。 免疫組織化学により、WD および WD + Fe グループの肝臓の炎症巣は iNOS 陽性 M1 マクロファージで構成されていることが明らかになりました。 免疫反応性は、小さな病巣（微小肉芽腫、図6g、矢印）よりも大きな炎症病巣（図6g、矢印）でより強い傾向があり、WDグループよりもWD + Feでより強い傾向がありました（補足図S4a- d)。 CD206 陽性 M2 マクロファージ 33 は類洞内に散発的に見られましたが、炎症巣とは直接の関係はありませんでした（図 6h、矢印、補足図 S4e-f）。 TNFα mRNAの発現も、ContおよびWDグループと比較して、WD + Feグループの内臓脂肪組織で増加しました（補足図S5a）。 レプチンの脂肪組織発現は、WDおよびWD + Feグループで減少しました（補足図S5b）。 IL6、アディポネクチン、および脂肪細胞の代謝に関与する遺伝子（PPARγ、Pde3b、Srebf1、Cpt1a、Acaca、およびDgat1）の発現は、グループ間で有意な差はありませんでした（補足図S5c-j）。

(a) WD および WD + Fe グループの脂肪肝における単核細胞浸潤を伴う微肉芽腫 (矢印) を表す組織学的画像。 Cont および Fe グループでは、炎症は存在しないか最小限です。 (b) 26 週目の肝小葉の炎症巣の数。26 週目の (c) TNFα、(d) IFNγ、(e) IL1β、および (f) IL10 mRNA の肝臓発現。データは 18S rRNA に正規化されました。コントロールからの変化倍数として表されます。 データはボックスアンドウィスカーとして表示されます (n = 4/グループ)。 *P < 0.05 対 Cont、†P < 0.05 対 WD、§P < 0.05 対 Fe (一元配置分散分析とそれに続く Tukey の多重比較による)。 26週目のWD + Feグループにおける(g) iNOSおよび(h) CD206のIHCの画像。矢印は微肉芽腫を示し、矢頭は大きな炎症巣を示します。 バー; 50μm。

食事による鉄過剰による肝臓炎症の増加のメカニズムを解明するために、この研究では、自然免疫応答および適応免疫応答および一連の病理学的炎症に関与する転写因子である核因子カッパ B (NFκB) を標的としました 34。 NFκB の核移行は、TNFα34 などの下流の標的遺伝子の転写を活性化します。 肝臓の核画分のNFκBレベルはWD + Feグループで増加しました（P = 0.03対ContおよびP = 0.0163対Fe）（図7a）、一方、細胞質NFκB発現はすべてのグループ間で有意に変化しませんでした（図7a）。 7b)。 次に、NFκB の上流経路に注目しました。 2 つのキナーゼ (IΚKα および IΚKβ) からなる IκB キナーゼ (IΚK) 複合体は、NFκB の中心的な制御因子です。 活性化された IΚK は、NFκB の結合タンパク質である IκB をリン酸化および分解し、NFκB の核移行を引き起こします 34,35。 リン酸化 Akt (Akt1 および Akt2 を含む) は、IΚKα リン酸化を介した NFκB 活性化因子としても知られています 36。 この研究では、モデルのすべてのグループ間でリン酸化 IΚK (図 7c) およびリン酸化 Akt (図 7d) の肝臓発現に有意な変化はありませんでした。 さらに、上記のように、リン酸化Akt2の肝臓発現はWD + Feグループでむしろ減少しました（図5d）。 NFκBの免疫反応性は、ContおよびFeグループの類洞細胞(おそらくクッパー細胞)の核に散発的に存在した(図7e、h)。 WDおよびWD + Feグループでは、小肉芽腫（図7f、g;黒い矢印）および大きな炎症巣（図7f、g;黒い矢印）の炎症細胞の核および細胞質で、中程度から強い免疫反応性が見られました。 炎症巣の周囲の一部の肝細胞は、NFκBの核免疫反応性を有していた(図7f、g;白矢印)。

26週目の(a)細胞質および(b)核画分におけるNFκBの肝臓発現、および(c)肝臓組織ライセート全体におけるホスホIκBキナーゼおよび(d)ホスホAktの26週目における発現。GAPDHおよびヒストンH2Bをローディングコントロールに使用した。それぞれ組織全体/細胞質および核画分に含まれます。 データは対照からの倍率変化として表され、箱ひげとして表されます (n = 4/グループ)。 *一元配置分散分析とそれに続く Tukey の多重比較による P < 0.05 対 Cont、§P < 0.05 対 Fe。 Cont (e)、WD (f)、WD + Fe (g)、および Fe (h) グループにおける NFκB (p65 または RelA) 免疫組織化学の画像。 バー = 50 μm。

NAFLD は MetS、特に肥満、インスリン抵抗性、T2DM、脂質異常症と密接な関係で発症します4。 NAFLD の現在のラット モデルでは、西洋食餌を与えると脂肪肝、高脂血症、肝インスリン経路の部分的変化が誘発されました。 このモデルは、炎症性サイトカインの上方制御を伴う肝炎症および軽度の肝損傷も表しており、NAFL から初期 NASH への移行表現型を示しています。 現在の WD + Fe モデルでは、西洋食餌に鉄過剰摂取を加えると、高トリグリセリド血症、高コレステロール血症、肝鉄蓄積、肝脂質過酸化の増加、M1 関連サイトカインの上方制御および NFκB の核移行を伴う肝炎症の悪化が生じました。 過剰な鉄分が NAFLD の病態に関与していることを示唆する多くの証拠があるにもかかわらず、NAFLD の病態はインスリン抵抗性、免疫状態、酸化ストレスなどのさまざまな要因によって複雑になるため、そのメカニズムは完全には解明されていません 4,5。 我々の結果は、鉄過剰が代謝状態を変化させ、脂肪肝疾患における肝炎症を増強する可能性があることを示唆し、ヒトにおけるNAFLDとDIOSの病理学的関連性を明らかにした。

DIOS は、以下の所見に基づいて臨床的に定義されます: MetS 成分の存在、正常なトランスフェリン飽和を伴う高フェリチン血症、および典型的に正弦波蓄積を伴う軽度の肝臓鉄過剰 17、18、19、20、21。 しかし、DIOS の病因についてはまだ議論の余地があります。 現在の WD モデルでは、トランスフェリン飽和度が正常で血清鉄が増加しており、血清トランスフェリンの鉄と結合する正常な能力が示唆されています。 食事による鉄補給と西洋食による給餌の組み合わせは、ヒト DIOS および NAFLD18、19、20、37 と同様に、肝ヘプシジンの上方制御を伴う主に類洞に沿った肝鉄蓄積を誘導します。 表 1 に示すように、MetS 表現型は、現在の WD + Fe モデル、ヒト NAFLD および DIOS の間で類似しており、このモデルとヒト DIOS および鉄過剰を伴う NAFLD との表現型の関連性が示唆されています。 血清フェリチンは、組織鉄を直接測定する代わりに、人間の臨床現場で体内の貯蔵鉄の代替マーカーとして一般に測定されます38,39。 しかし、血清フェリチンには少量の鉄しか含まれていないため、ラットの体内の鉄貯蔵量とは独立しています40。 したがって、体内の鉄貯蔵状態をヒトの状態と比較する際に、ラットモデルの肝臓の鉄含有量を評価しました。 Fe (485.2 mg/kg 体重/日) および WD + Fe (444.3 mg/kg 体重/日) グループの 1 日あたりの平均鉄摂取量は、対照ラット (15.1 mg/kg 体重/日) よりも約 32 倍および 30 倍高い体重/日)、それぞれ。 体重に基づいて計算すると、Fe 群と WD + Fe 群の 1 日あたりの平均鉄摂取量は、男性の 1 日あたりの平均鉄分摂取量（0.25 mg/kg 体重/日）よりもそれぞれ約 1777 倍と 1940 倍高くなります41。 高フェリチン血症および/または異常な血清鉄を有する NAFLD 患者の肝鉄含有量は 980 ～ 5070 μg/g 乾燥体重で、これは臨床鉄過剰評価尺度では正常から軽度から中等度の鉄過剰です 42,43,44。 現在の WD + Fe モデルでは、肝鉄含有量は 858 ～ 1574 μg/g 乾燥重量と計算でき、肝鉄の正常から軽度の増加が示唆されています 45。 私たちの WD + Fe モデルは、鉄調節不全のあるヒト NAFLD 患者と同様の鉄状態を有すると考えられています 44。

現在の WD + Fe モデルの限界は、典型的な NAFLD や DIOS のように肝臓のインスリン抵抗性が完全には変化しないことです。 インスリン抵抗性は、脂肪毒性、酸化ストレス、炎症カスケード活性化とともに、NAFLD の発症と進行につながる「多重ヒット」の主要な部分を占めています5。 肝細胞におけるインスリンによるグルコース産生の抑制障害として定義される肝臓のインスリン抵抗性も、代謝障害の重要な要素です 30,46。 肝臓のインスリン抵抗性は全身性インスリン抵抗性の前に発症するため、肝臓のインスリン抵抗性が全身のインスリン抵抗性の発症を開始する可能性があることが示されています47。 現在の WD および WD + Fe モデルでは、肝臓のインスリン経路が部分的に変化していることが示されました。 しかし、FOXO1 の核移行は糖生成遺伝子の下方制御の影響を受けませんでした。 肝臓では、糖新生は、cAMP 応答要素結合タンパク質複合体の PDK1 依存性分解および AKT2-FOXO1 経路によって抑制されます 48。 インスリン受容体基質に関しては、IRS1 だけでなく IRS2 も肝臓のグルコース産生の阻害に関与しています 49。 このモデルでは、糖生成は IRS1-Akt 2 抑制に応答してこれらの代替経路を介して制御されている可能性があると考えられます。 このモデルでは肝臓のインスリン カスケードを変更するために、飲料水でのフルクトースとグルコースの負荷が選択されました。 フルクトースおよびグルコースの過剰摂取がMetS発症の主な原因として示唆されているため、フルクトースおよび/またはグルコース溶液は齧歯動物モデルでMetS表現型を誘導するために広く使用されています47,50,51。 私たちのモデルで明確なインスリン抵抗性を得るには、肝臓または全身のインスリン抵抗性を示す以前の研究と同じくらい糖分を増やすことが効果的です50,52。 私たちのモデルでMetSを促進する別の方法は、化学的に誘導されたモデルや遺伝子組み換えモデルなど、確立された糖尿病モデルに西洋食を与えることです。 前者には、低用量のストレプトゾトシン治療を伴う T2DM モデルが含まれます 53。 ただし、ストレプトゾトシン誘発性のβ細胞障害は、自然の病因よりもはるかに深刻であることに注意する必要があります53,54。 後者には、レプチン-レプチン受容体軸欠損を有する齧歯動物（ob/ob マウス、db/db マウス、Zucker fat ラット）および自然発生的 D2M を有する齧歯動物（KK マウス）が含まれる。 これらの動物は肥満によりインスリン抵抗性を発症します51,54。 糖尿病の誘導と西洋食の給餌を組み合わせれば、ヒトの NAFLD と MetS をより明確に模倣する優れたモデルが得られる可能性があります。

この研究では、食事による鉄過剰は、TNFαやIFNγなどのサイトカインの上方制御を伴い、西洋食誘発性肝炎症を悪化させます。 同様の所見は、げっ歯類の NAFLD モデルを用いた以前の研究でも得られました 22,55。 さらに、現在のWD + Feモデルにおける肝臓炎症の悪化は、マクロファージ/クッパー細胞における激しい鉄蓄積およびNFκBの核移行の増加と関連していることが示された。 NFκB の核移行は、WD + Fe モデルの炎症巣において特に顕著でした。 TNFα は肥満およびインスリン抵抗性に関連しており、TNFR134、56、57 に結合することにより NFκB 駆動炎症の活性化因子としても知られています。 肝臓および脂肪の TNFα および肝臓 TNFα 受容体の発現は、NASH 肥満患者では非 NASH 肥満患者と比較して増加します 58。 同様に、現在の WD + Fe モデルでは肝臓と内臓脂肪組織の両方で TNFα 発現が上方制御されており、肝臓と内臓脂肪組織から産生される TNFα が肝炎症の悪化に寄与している可能性があることが示唆されています。 NFκB 活性の増加は、齧歯動物における脂肪変性、肝インスリン抵抗性、炎症などの MetS 要素の発症にも関連しています 5,57,59。 NFκB の活性化は、NASH 患者の肝生検でも証明されています 60,61。 さらに、いくつかの研究は、過剰な鉄が培養クッパー細胞において IΚK を介して NFκB 活性化と TNFα アップレギュレーションを直接誘導することを示唆しています 62,63。 TNFα-NFκB 相互作用は、現在の WD + Fe モデルにおいて肝炎症を促進する可能性があります。 IFNγ は主にヘルパー T 細胞に由来し、主に Th1 タイプの免疫応答に関連しています 64。 ヒト NAFLD における Th1 細胞の役割に関するデータは限られていますが、NASH 患者では IFNγ 産生 T 細胞の数の増加が観察されました 65。 IFNγ は、TNFα や IL1β などの炎症誘発性サイトカインを分泌する M1 マクロファージも活性化します 33,66。 現在の WD + Fe モデルでは、炎症巣の単核白血球は iNOS に対して強い陽性を示す一方、CD206 に対しては陰性であり、M1 マクロファージが主に炎症巣から構成されていることが示唆されています。 鉄誘導性の Th1/M1 免疫応答も、現在の WD + Fe モデルにおける肝臓炎症の亢進に寄与している可能性があります。

脂質異常症は、有病率が高く (NAFLD 患者の 20% ～ 80%)、MetS と同様に NAFLD の主な臨床特徴の 1 つであり、心血管疾患の危険因子として注目されています 67。 これらの証拠は、このモデルが複数の MetS コンポーネントを含むヒト NAFLD の重要な表現型を表すため、このモデルの有用性を裏付けると考えられます。 さらに、食事による鉄過剰は血清トリグリセリドと総コレステロールを増加させますが、現在の WD + Fe モデルでは肝臓トリグリセリドは増加させません。 グラハムら。 肝臓の鉄負荷がマウスの肝臓コレステロール合成を増加させることを実証しました68。 さらに、現在の WD + Fe モデルに見られるように、肝細胞における NFκB シグナル伝達経路の活性化は、コレステロール合成を含む脂肪生成を促進することが示されています 69。 これらの発見は、肝臓の鉄過剰が脂質代謝、特にコレステロール代謝を変化させる可能性があることを示唆しています。

酸化ストレスは、NAFLD の「多重ヒット」の 1 つとみなされ、インターフェロン制御因子や NFκB27、28、70 などの転写因子の活性化を介した、NAFLD 発症中の自然免疫シグナル伝達の活性化に関連していると考えられています。 鉄過剰は、フェントン反応による高活性酸素種であるヒドロキシルラジカルの生成を介して組織損傷を引き起こす可能性があります9。 しかし、脂質過酸化のマーカーである肝臓の MDA 含有量の増加 28 は、現在の WD + Fe モデルでは穏やか (2 倍未満) であり、酸化ストレスと抗酸化物質の指標である血清トランスアミナーゼや肝臓の GSH/GSSG 比に大きな変化はありませんでした。バランス27。 さらに、肝臓の鉄蓄積は、高フェリチン血症または DIOS を伴う NAFLD 患者と同様に、現在の WD + Fe モデルでも軽度から中等度でした 19,20。 これらの発見は、肝毒性を持たない量の鉄の蓄積が、代謝性肝疾患において直接的な肝損傷を誘発するのではなく、マクロファージ/クッパー細胞の活性化を介して脂質異常症や肝炎症を促進する可能性があることを示唆しています。

結論として、我々の結果は、肝鉄過剰症を伴う新しい NAFLD モデルが、高フェリチン血症および DIOS を伴うヒト NAFLD の多くの特徴を共有することを実証しました。 西洋食誘発性脂肪肝疾患に鉄過剰の食事が加わると、NFκBの活性化により肝臓の炎症が悪化し、脂質代謝が変化することから、「多重ヒット」因子の1つとしてNAFLDの発症と進行における鉄の重要な役割が示唆されている。 実験モデルをさらに改良すれば、ヒト NAFLD と DIOS の間の架橋がより明確に解明されるでしょう。

この研究で行われた実験は、ARRIVE ガイドライン (https://arriveguidelines.org) に従って報告されています。 生後 10 週の雄 F344/DuCrlCrlj ラット (チャールズ リバー ラボラトリーズ ジャパン、横浜、日本) を対照 (Con)、西洋食 (WD)、西洋食 + 高鉄食 (WD + Fe)、および高鉄食 (WD + Fe) に分けました。鉄 (Fe) グループ (各グループ n = 4); 実験開始時の体重の平均はグループ間で同様でした。 減少（動物数の最小化）および実験精度（個体差の影響の最小化）の観点から、グループあたり 4 つのサンプルサイズが決定されました。 ケージあたり 2 匹または 3 匹のラットを、温度が制御され、12 時間の明暗サイクルのある部屋で維持しました。 食物および水は自由に与えた。 ラットには、補足表 S1 に示す食事を 26 週間与えました。 クエン酸鉄（FeC6H5O7・5H2O）を6％の濃度で配合した高鉄食を調製しました。 体重、食物摂取量および水分摂取量を週に１回測定した。 26週間の給餌後、ラットを深いイソフルラン麻酔下で安楽死させ、全血、肝臓、皮下（鼠径部）および内臓（精巣上体周囲）の脂肪組織、脾臓、膵臓、盲腸内容物、心臓、腎臓および肺を採取した。 。 すべてのラットを、除外することなく以下に記載する分析に含めた。 この研究では交絡因子は制御されていませんでした。 ただし、得られたデータを観察する限り、処理と測定の順序の影響は最小限であると考えられます。 著者のうち 2 人 (SF と TI) は、実験のさまざまな段階でのグループ割り当てを認識していました。 すべての実験は大阪府立大学の動物管理使用委員会（コード番号 29 ～ 184 および 30 ～ 71）によって承認され、大阪都立大学の動物実験ガイドラインに従って実施されました。

腹部大動脈から血液を採取し、室温で１時間放置した。 血清を遠心分離（3000 rpm、10分間）により分離した。 生化学分析は SRL Inc. (東京、日本) で実施されました。

肝臓の左側葉と尾状部を 10% 中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、5 μm に切断し、組織病理学的検査のためにヘマトキシリンおよびエオシン (HE) で染色しました。 炎症巣の数を数えた。 各動物から左葉側葉切片の 200 倍視野 10 個を評価しました。 データは、200 × フィールドあたりの炎症巣の数として表示されました。

肝臓の中の中性脂肪含有量を調べるために、トリグリセリド E-test Wako キット (和光純薬工業、東京、日本) を製造者の指示に従って使用して肝臓中性脂肪アッセイを実施しました。

肝臓の左側葉および尾状部の切片を、補足表S2に記載されている一次抗体を用いた免疫組織化学(IHC)に供した。 脱蝋および抗原回復後、組織切片を、以前に記載されているように Histostainer システム (ニチレイ バイオサイエンス、東京、日本) で免疫染色しました 71。 簡単に説明すると、切片をリン酸緩衝食塩水 (PBS) 中の 5% スキムミルクで 10 分間、各一次抗体で室温で 1 時間、PBS 中の 3% H2O2 で 15 分間、および西洋わさびペルオキシダーゼ結合二次抗体で処理しました。 (ヒストファイン シンプル ステイン MAX PO、ニチレイ バイオサイエンス) 室温で 30 分間。 陽性反応は3,3'-ジアミノベンジジン(DAB基質キット;ニチレイバイオサイエンス)を用いて視覚化した。 免疫組織化学後、組織鉄を検出するために切片を Perls 溶液で染色しました。

血清インスリンレベルは、LBIS ラットインスリン ELISA キット (Shibayagi Co.、群馬、日本) を製造者の指示に従って使用して分析しました。

脂質過酸化変化を調べるために、以前に記載されているように、MDA アッセイキット (Northernwest Life Science Specialities、カナダ、バンクーバー) を使用して、肝臓の MDA 含有量をチオバルビツール酸反応性物質 (TBARS) 法によって分析しました。

肝臓の抗酸化活性を調べるために、GSSG/GSH 定量化キット (Dojindo、熊本、日本) を製造業者の指示に従って使用して、肝臓の GSSG/GSH 比を分析しました。

リアルタイム RT-PCR は、以前に記載されているように、主要なサイトカイン遺伝子および鉄代謝に関連する遺伝子の発現パターンを調べるために実行されました 71。 右中葉、精巣上体脂肪組織、および鼠径部脂肪組織からの肝臓サンプルを RNA 後期試薬 (Qiagen、ヒルデン、ドイツ) に浸し、使用前に -80 °C で保存しました。 SV Total RNA Isolation System (Promega、WI、USA) を使用して全 RNA を抽出しました。 2.5 マイクログラムの全 RNA を、SuperScript VILO cDNA 合成キット (Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州、米国) によって cDNA に逆転写しました。 リアルタイム PCR は、PikoReal Real-Time 96 PCR System (Thermo Scientific、マサチューセッツ州、米国) で TaqMan 遺伝子発現アッセイ (Life Technologies) を使用して実行されました。 プローブの詳細は補足表 S3 に記載されています。 真核生物の 18sRNA と βactin を参照遺伝子として使用しました。 データは 2-ΔΔCT 法で計算されました。

右中葉からの全組織ホモジネートを、以前に記載されているように調製した71。 細胞質/核画分の調製のために、右中葉からの肝臓サンプルを、10 mM HEPES/KOH (pH 7.5)、10 mM NaCl、3 mM MgCl、0.5% NP-40、1 mM PMSFおよびプロテイナーゼ阻害剤のカクテル。 3100×gで5分間遠心分離した後、上清を細胞質画分として回収した。 沈殿を、10 mM HEPES/KOH (pH 7.5)、25 mM NaCl、3 mM MgCl、300 mM スクロース、1 mM PMSFおよびプロテイナーゼ阻害剤カクテルを含む別の緩衝液200 μLと混合し、3100 xgで5分間遠心分離した。 10 mg/mL DNase I で処理し、氷上で超音波処理した後、サンプルを核画分として収集しました。 タンパク質濃度は、Bio-Rad タンパク質アッセイ (Bio-Rad Laboratories、カリフォルニア州、米国) を使用した吸収分光計によって測定されました。 サンプルは 5 ～ 20% 勾配ポリアクリルアミドゲルで分離され、ポリ二フッ化ビニリデン (PVDF) 膜 (Bio-Rad Laboratories) に転写されました。 一次抗体とインキュベートする前に、膜をサイズごとにいくつかの断片に切断し、補足表S4に記載されているように一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートし、続いてペルオキシダーゼ結合二次抗体（Histofine Simple Stain MAX PO；Histofine Simple Stain MAX PO;ニチレイバイオサイエンス）30分間シグナルはECLプライム(GE Healthcare、英国リトルチャルフォント)で視覚化し、発光画像分析装置(LAS-4000; GE Healthcare)で定量した。 分析されたバンド画像を補足図S6a〜mに示します。

データは平均値 ± SD として表示されます。 統計分析は、一元配置分散分析を使用し、その後 Prism ソフトウェア (バージョン 9.4.1.; GraphPad、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国; https://www.graphpad.com/scientific-software/) による Tukey-Kramer 検定を使用して実行されました。プリズム/）。 P < 0.05 の値は統計的に有意であるとみなされました。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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松尾友恵さん、浜地奈々さん、伊賀倉洋子さんの素晴らしい技術サポートに感謝いたします。 この研究は、JSPS 科研費（助成番号 20K06415）の助成を受けています。

大阪首都大学獣医病理学研究室 〒598-8531 大阪府泉佐野市りんくう往来北1-58

Sakura Fujiwara, Takeshi Izawa, Mutsuki Mori, Machi Atarashi, Jyoji Yamate & Mitsuru Kuwamura

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SF: 実験計画、実験とデータ収集、原稿執筆。 TI: 実験計画、実験とデータ収集、レビューと編集。 MM: 実験とデータ収集。 MA: 実験とデータ収集。 JY: レビューと編集。 MK: レビューと編集。

井沢剛氏への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

藤原真司、井沢達也、森正人 他食事による鉄過剰は、西洋食による肝炎症を促進し、ラットの脂質代謝を変化させます。この変化はヒト DIOS と類似しています。 Sci Rep 12、21414 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-25838-3

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受信日: 2022 年 6 月 27 日

受理日: 2022 年 12 月 6 日

公開日: 2022 年 12 月 10 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25838-3

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