熱ストレスに応答した反芻動物の成長期における HSP70 遺伝子の差次的発現と制御

Scientific Reports volume 12、記事番号: 18310 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

熱ショックタンパク質は、熱ストレス適応の生理学的機構を細胞レベルで調節します。 本研究は、反芻動物のさまざまな成長段階における末梢血単核球 (PBMC) における HSP70 遺伝子制御を分析するために実施されました。 反芻動物における年齢特異的な HSP 遺伝子発現と耐熱性の関係は解析されていません。 したがって、m-RNA HSP70 発現レベルを、暑い気候条件下でのジャムンパリヤギのさまざまな年齢グループで調べました。 実験は、生後3ヵ月、9ヵ月、12ヵ月、成体（2〜3歳）の年齢グループに属する32頭のジャムナパリヤギで実施されました。 全RNAを末梢血単核細胞から単離した。 直腸温 (RT)、呼吸数 (RR)、心拍数 (HR) などの生理学的反応が、熱ストレスの指標として使用されました。 温度湿度指数 (THI) は、環境ストレスの深刻度の指標として使用されました。 実験期間中の THI 範囲は 82.00 ～ 92.08 で変動しました。 9 か月齢の動物の m-RNA HSP70 発現レベルは上方制御され、他の年齢グループよりも有意に高かった。 PBMC における HSP70 転写物のレベルは生後 9 か月のグループで最も高く、成人年齢では HSP70 発現の加齢に伴う低下が観察されました。 生理学的反応に基づいて、対照的な熱ストレス表現型を熱ストレス感受性 (HSS) および熱ストレス耐性 (HST) 個体として認識し、慢性熱ストレスに応答するさまざまな年齢における m-RNA HSP70 の発現を分析しました。 生後 3 か月および 9 か月の HSS 個体の mRNA 発現差は、HST よりも最も高い発現倍数を示しました。 年齢と表現型は、クロッシングポイント (CP) 値に有意な影響を及ぼしました (p < 0.01)。 さまざまな年齢層における m-RNA HSP70 遺伝子発現は熱ストレス耐性と相関しており、これは飼育者が反芻動物の in vivo での HSP 応答を分析するためのバイオマーカーとして使用できる可能性があります。

暑熱順化と熱適応は、熱ショックタンパク質（HSP）の基礎レベルの増加と関連しています1,2。 HSP は、さまざまな環境やその他のストレス要因に反応して活性化されます。 皮膚上皮は、熱ストレスに応答して熱ショックを動員するために熱ショックタンパク質を放出することが観察されている。 皮膚温度が反芻動物の熱中性帯の上限に近づくと、誘導性 HSP70 の発現が数倍増加します。 熱ストレス制御経路は、温度上昇や酸化損傷に応答してすべての細胞のプロテオームを保護します 3,4。 細胞レベルでは、熱やその他の代謝ストレス因子が HSP を誘導し、熱ショック転写因子 (HSF) の活性化により遺伝子発現を増加させます 5、6、7。 HSP はストレス条件下で他の細胞タンパク質と相互作用し、細胞の恒常性を維持します8。 個々の動物は、タンパク質のフォールディングを促進することによって中核となる生物学的プロセスを保護するさまざまなストレス調節経路を活性化することによって、生理学的ストレスおよび環境ストレスに応答します。 HSP は、ストレスに応答して誘導可能な形で細胞内および細胞外に放出されます。 熱ストレスに対する細胞の耐性は HSP によって調節されており、HSP70 は細胞のストレスの指標となりえます 9。 HSP は、ストレスに順応するために、生体内の生存と効果的な免疫システムの間のバランスを維持する責任があります10。

熱ストレスに耐える能力は、成人のフィットネスの重要な要素です。 細胞は代謝ストレスまたは環境ストレスに応答して熱ショックタンパク質を放出します8。 ラットの初代線維芽細胞では、加齢に伴い熱誘発性の HSP 70 m-RNA 発現が低下することが観察されています 11。 同様に、細胞継代（インビトロ老化）の関数として、ヒト二倍体線維芽細胞における熱誘発性の HSP70 発現の低下が報告されています。 生理学的レベルでの年齢依存の体温調節は、人間だけでなく実験動物でも観察されています12。 HSP が生体内組織レベルでストレス耐性を調節することも示されています 13。 したがって、本研究は、反芻動物の熱ストレスに応答した加齢に関連した m-RNA HSP70 発現を分析するために実施されました。 この研究は、熱ストレス期間中の1歳までの動物および成人個体の体温調節のメカニズムを観察するためにin vivoで実施されました。 HSP 70 m-RNA 発現は、成熟年齢までの反芻動物の成長期、および熱ストレスに応答した成体動物で分析されました。 in vivo の老化プロセスに関する HSP70 発現の制御は、反芻動物では行われていません。 反芻動物におけるHSP70タンパク質の発現差はまだ解析も理解もされていないため、本研究では熱ストレス期間中のさまざまな年齢における熱ショックタンパク質の発現パターンを解析する。

実験期間中の環境温度は 40 ～ 49.5 °C で変化しました。 高温期の温湿度指数 (THI) は 82.0 ～ 92.08 の範囲で変化しました。 直腸温 (RT)、呼吸数 (RR)、心拍数 (HR) などの生理学的反応は、熱ストレス期間中の動物で大きな変動を示しました。これを表 1 に示します。RT、RR、HR の変動範囲は 38.1 でした。高温期はそれぞれ、温度が 39.9 °C まで、呼吸数が 24 から 84 回/分、心拍数が 100 から 160 回/分です (表 1)。 集団レベルでの表現型の違いの分類は、以前に提示されたデータに基づいています。 RR および HR の分布に基づいて、RR ≤ 34 (呼吸/分) および HR ≤ 108 (拍動/分) を有する個人が熱ストレス耐性表現型 (HST) として認識されました。 ただし、RR ≧ 50 (呼吸/分) および HR ≧ 130 (心拍/分) は、熱ストレス感受性表現型 (HSS) として認識されました。 ストレス感受性表現型に関する極度の熱ストレス期間中の生理学的反応の平均変動を表2および補足図1に示します。RT、RR、およびHRの平均は、熱ストレス感受性表現型と耐性表現型内で有意な変動を示しました。 熱感受性表現型のRT、RR、HRの平均は、それぞれ39.277℃、70.923呼吸/分、145.538拍/分であった。 熱ストレス感受性表現型と耐性の平均は、RTでは0.859℃、RRでは39.650呼吸/分、HRでは37.083拍/分の差があった。 HSS および HST ストレス表現型に関する、さまざまな年齢における生理学的反応の平均変動を表 3 に示します。RT、RR および HR は、さまざまな年齢グループの HSS 表現型と HST 表現型の間で有意に (P < 0.01) 異なりました。 したがって、RT、RR、および HR は動物の年齢によって有意に (P < 0.01) 影響を受けました。

高温期のジャムナパリヤギの異なる年齢群において、HSP70の相対的なm-RNA発現レベルを分析した。 HSP70 の m-RNA 発現パターンを、ストレス表現型に関して生後 3、9、12 か月および成人 (2 ～ 3 歳) で分析しました。 グリセルアルデヒド 3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH) およびベータ アクチン (β-アクチン) 遺伝子を内部対照として使用しました。 RT-PCRを使用した増幅産物の品質（補足図2）、増幅曲線および融解ピークを補足図3Aおよび図3Bに示します。 3、9、12 か月および成人年齢における HSP70 遺伝子の相対的な m-RNA 発現パターンは、成人対照 (熱ストレス感受性) と比較して 5.70、23.90、4.08、および 1.51 のアップレギュレーションを示しました (表 4 および図 1)。 m-RNA 発現は、他の年齢グループと比較して、動物の生後 9 か月で有意に高かった。 生後9か月のジャムナパリヤギのHSP70遺伝子の発現は、キャリブレーター（対照群）と比較して23.9倍高かった。 さらに、生後9か月では、生後12か月および成人に比べて、それぞれ5.86倍および15.83倍高いm-RNAレベルが示されました（表4および図1）。

ジャムナパリヤギの異なる年齢群における HSP70 遺伝子の相対的な mRNA 発現 (変化倍数)。 3M、生後3か月の動物。 9 男、生後 9 か月の動物。 12M、生後12か月の動物。 成体、動物の年齢は 2 ～ 3 歳。 次に、各未知サンプルのクロスポイント (Cp) 読み取り値を使用して、Lightcycler 480 分析ソフトウェア バージョン 1.5 (Roche Applied Science、米国イリノイ州インディアナポリス) を使用した二次導関数最大値法を使用して、標的遺伝子またはハウスキーピング遺伝子の量を計算しました。 ）。 GADPH と β-アクチンを使用して遺伝子発現を正規化しました。 感受性の高い個体を、正規化された遺伝子発現を取得するためのポジティブキャリブレーターとして使用しました。

しかし、対照的な熱ストレス感受性表現型と耐性表現型の間のm-RNA発現の差異は、生後3、9、12ヶ月および成人年齢のHSS個体が対照よりも3.57、32.34、3.70および0.54倍高い発現を示すことを示した。 同様に、3、9、12 か月の HST 個体および成人は、対照よりも 3.20、17.66、4.50、および 4.41 倍高い発現を示しました。 熱ストレス表現型に基づく HSP70 遺伝子の m-RNA 発現は、動物の生後 3 か月および 9 か月で、熱ストレス感受性表現型においてそれぞれ 3.57 倍および 32.34 倍高かった。 同様に、熱ストレス耐性表現型は、高温期の生後3か月および9か月で3.20倍および17.66倍低い発現を示しました（表5および図2）。

HST および HSS 表現型に関するジャムナパリ ヤギのさまざまな年齢グループにおける HSP70 遺伝子の相対的な mRNA 発現 (倍率変化)。 3 M-HST、動物の生後 3 か月 - 熱ストレス耐性表現型。 3 M-HSS、動物の生後 3 か月 - 熱ストレスに敏感な表現型。 9 M-HST、動物の生後9か月 - 熱ストレス耐性表現型。 9 M-HSS、動物の生後9か月 - 熱ストレスに敏感な表現型。 12 M-HST、動物の生後 12 か月 - 熱ストレス耐性表現型。 12 M-HSS、動物の生後 12 か月 - 熱ストレスに敏感な表現型。 成体-HST、動物の成体（2～3歳）年齢-熱ストレス耐性表現型。 成体-HSS、成体92～3歳の動物年齢-熱ストレスに敏感な表現型。 次に、各未知サンプルのクロスポイント (Cp) 読み取り値を使用して、Lightcycler 480 分析ソフトウェア バージョン 1.5 (Roche Applied Science、米国イリノイ州インディアナポリス) を使用した二次導関数最大値法を使用して、標的遺伝子またはハウスキーピング遺伝子の量を計算しました。 ）。 GADPH と β-アクチンを使用して遺伝子発現を正規化しました。 感受性の高い個体を、正規化された遺伝子発現を取得するためのポジティブキャリブレーターとして使用しました。

ジャムナパリヤギの異なる年齢グループにおけるクロッシングポイント(CP)値の最小二乗平均を分析した。 表 6 は、誕生の季節、出生型、性別、年齢、表現型、経産数の影響を示しています。 HSS 表現型は、HST 表現型よりも有意に高い (p < 0.01) CP を示しました。 表現型相互作用による性別は、CP に関して有意な差 (p < 0.01) を示しました (表 7)。 しかし、CP では出生季節、出生型、性別に有意差は認められなかった。 ＡＮＯＶＡ表により、年齢、表現型、および経産数がＣＰに有意な影響を及ぼした（ｐ＜０．０１）ことが明らかになった（表８）。 同様に、出生の季節、出生の種類、年齢、経産数も体重に有意な影響を及ぼしました (p < 0.01)。

HSP 70 は熱ストレス中に保護的な役割を果たし、また正常な細胞の成長と増殖も調節します。 HSP は、酸化ストレスを介して媒介されるアポトーシスから細胞を保護します24。 細胞の熱ストレス耐性は HSP によって調節されており 25、26、27、HSP70 はさまざまな種の熱ストレス耐性のマーカーと考えられています 28、29。 家畜の加齢に伴う熱ストレス制御と高温環境条件における熱耐性は、十分に理解されていない。 HSP70 の m-RNA 発現パターンは、ジャムナパリ ヤギにおいて HSP70 遺伝子発現が生後 12 か月および成体と比較して生後 9 か月で有意に高いことを示しました。 m-RNA HSP70 の発現は、生後 12 か月および成人年齢と比較して、約 5.85 倍および 15.75 倍高かった。 3、9、12 か月齢および成人年齢における m-RNA HSP70 遺伝子の発現レベルは、成人対照 (熱ストレス感受性個体) と比較して 5.70、23.90、4.082、および 1.51 のアップレギュレーションを示しました。 ヤギの成長と発育は、他の反芻動物や哺乳類と同様の方法で起こります。 成長は、胚の受精で始まり死で終わる各動物のライフサイクルの関数です。 細胞は成長と発達の基本単位です。 成長と発達の速度は、遺伝的可能性と環境要因の両方によって支配されます。 胎児の成長期は分化から出産までです。 出生後の成長と発達に影響を与える要因は、遺伝的可能性と、遺伝的構成を達成するための環境と栄養の影響です。 ヤギは生後9か月で成熟し、免疫システムが成熟する年齢です。 明らかなように、母親の免疫は生後6か月までの個人に影響を与えます。 したがって、生後9か月は、成長やその他の経済的特性によって個人を選択する年齢です。 性的成熟とは、哺乳動物が生殖し、あらゆる段階で発達を達成できる年齢です。 げっ歯類の科は生後 1 ～ 2 か月で性的成熟に達し、イヌ科とウシ科は約 1 歳で性的成熟に達し、ヒトを含む霊長類は 23 歳で性的成熟に達します30。 成長と発展は、外部環境と内部環境の単一かつ相互作用する複数の要因によって決定されます。 ヤギの成長と発達、および生産の効率と製品の品質を決定するため、これらのプロセスに影響を与える要因を理解することが必要です。 人間の健康を改善し、資源を効果的に管理するには、成長の速度と効率、およびその後の製品の品質への影響を、構想から消費まで操作する必要があります31。 発現パターンとその生存との関連性の探求、および適応は、家畜の改良および繁殖計画において大きな期待を抱いています。

同様に、3、9、12歳および成人におけるHSP70のm-RNA発現は、それぞれ、HSS表現型では3.57、32.34、3.70および0.54倍、HST表現型では3.20、17.66、4.50および4.41倍であった。 示差的な m-RNA 発現は、生後 3 か月および 9 か月の HSS 個体が HST よりも最も高い発現倍数を有することを示しました。 同様に、HSP60 および HSP70 の m-RNA 遺伝子発現プロファイル研究もザーネンヤギで報告されています 32。 さらに、乳用ヤギでは、環境条件と生理学的パラメーターの間に HSP70 と 60 の有意な正の相関関係が観察されました 33。 HSP60 および 70 濃度の季節プロファイルは、夏と比較して冬季に少ないことが報告されており、ヤギの HSP 濃度と生理学的データの間に正の有意な相関関係が見出されています 34。 この研究では、1 ～ 2 歳（最年少グループ）の動物が、3 ～ 4 歳および 5 ～ 6 歳の個体と比較して、HSP 発現の最も高い増加を示しました。 さらに、季節変動も記録され、HSP70 レベルは他の季節と比較して夏に HSP60 および HSP70 発現の上昇が見られました。 これらの発見は、小型哺乳類、特に雄のウィスターラットなどのげっ歯類とも一致しています11。 11歳のラットの初代線維芽細胞では、熱によって誘導されるHSP70 m-RNAの発現が低下することが確認されています。また、HSP70の発現は、成体ラット（生後22〜28ヶ月）ではラットよりも40〜50パーセント低かったです。若いラット (4 ～ 7 か月) を 42.5 °C に 30 分間曝露した場合。 本研究では、生理学的反応は熱ストレス感受性表現型と熱ストレス耐性表現型内での有意な変動を示しました。 同様に、血清レベルの HSP70 は、南七面鳥条件下の乳ヤギのいくつかの生理学的パラメーターと関連していました 36。キイロショウジョウバエでは、HSP70、HSP22、および HSF1 の年齢依存性および性別依存性発現が研究され、HSP70 発現が生涯を通じて低下することが観察されました。 -スパン。 HSP の誘導は恒常性の維持に重要であり、その発現の欠損は加齢に伴うストレス耐性の低下に寄与する可能性があります。 視床下部-下垂体軸 (HPA) 機能の変化は、年齢 37、38、39、40、41、42、43 歳で起こることが知られています。 急性ストレスに対する副腎皮質反応の誘発には加齢に伴う欠損はないことが報告されているが、高齢の動物では繰り返しストレスにさらされると HPA 活性の低下が起こることが示唆されている 44。 したがって、加齢に伴う HSP70 発現の低下は、HSP70 遺伝子制御における固有の変化ではなく、HPA 活性の変化を反映している可能性があります。 HSP70 は、これらのストレス条件に対処するための保護的な役割を果たしているようであり、その後の攻撃から細胞を保護する機能を果たしている可能性があります 13,45,46。

HSP70 遺伝子発現の制御は複雑です。 同様に、細胞継代（インビトロ老化）の関数としての、ヒト二倍体線維芽細胞における熱誘発性のHSP70発現の低下。 HSP70 の転写機構は年齢に応じて変化し、これは熱ショック応答のシグナル伝達機構における加齢に伴う変化によるものである可能性があります 47。 生理学的レベルでの年齢依存の体温調節は、人間だけでなく実験動物でも観察されています12。 ヒト末梢血単核細胞を用いた予備研究では、熱誘発性の HSP70 をコードする遺伝子転写の 30% のインピーダンスが、若者と比較して高齢者で観察されました 48。 ヒトでは、血清 Hsp70 は 30 年以内は年齢と正の相関があり、40 年以降はリンパ球の Hsp70 レベルと負の相関がありました 49。 今回の結果は、成長期における反芻動物の耐熱性のメカニズムと、成長と経済的形質に影響を与える要因についての理解を向上させる可能性がある。 したがって、熱ストレス期間中のさまざまな年齢層におけるm-RNA発現とタンパク質発現との相関を解析する必要がある。 同様に、変化する気候変動における適応性を高め、生産性を維持するために、動物の血清タンパク質を評価し、特定の集団の熱ショックバランス指数 (eHsp70/iHsp70) を決定することも必要です。

動物の9か月齢におけるm-RNA HSP70発現レベルは、他の年齢群よりも上方制御されていた。 HSP70 m-RNA レベルは、ジャムナパリ ヤギの生後 3 か月および 9 か月の HST 個体で高かった。 生後9か月は、成長やその他の経済的特性を考慮して個体を選択する年齢です。 さまざまな年齢層における m-RNA HSP70 遺伝子発現は熱ストレス耐性と相関しており、これは飼育者が反芻動物の in vivo での HSP 応答を分析するためのバイオマーカーとして使用できる可能性があります。

この実験は、インドのウッタル・プラデーシュ州マトゥラー市マフドゥームにあるICARヤギ中央研究所（ICAR-CIRG）のジャムナパリ繁殖ユニットで行われた。 ジャムナパリは、インドで最も乳量が多く、大型のヤギ品種の 1 つで、ウッタル プラデーシュ州の半乾燥地域に分布しています14。 研究地域の気候は半乾燥で、実験期間中の平均気温は 45 °C、降水量は約 400 mm でした。 動物（ヤギ）は、性別、年齢、健康状態および生理学的状態に基づいて個別に飼育され、6 ～ 7 時間の放牧時間を持つ準集中飼育システムの下で管理されました。 生理学的および生産状況に基づいて、乾燥飼料や緑色飼料を含む適切な動物飼料が提供されました。 身体状態スコアは、すべての動物について適切かつ均一でした。 定期的に、群れにはワクチン接種と駆虫が行われた。

この調査は、インドの半乾燥地域に生息するジャムナパリヤギ品種で実施され、表 9 に示すように 4 つの年齢グループに分類されました。成長期の子供では、呼吸数 (RR)、心拍数 (HR) などの生理学的反応が観察されます。 、直腸温度（RT）が熱ストレスの指標として記録されました。 生理学的反応は、その日の最高気温が 13:30 から 14:30 までの範囲で記録されました。 さまざまな年齢における生理学的反応が、8 ～ 10 日間 (5 ～ 6 月) にわたって 3 回記録されました。 デジタル体温計を使用して直腸温度を測定しました (精度 ± 0.1 °C)。 RR と HR は、前述したように聴診によって測定されました 15。

気象変数 (相対湿度 (%)、日照時間 (h)、降水量 (mm)、乾球温度 (DBT) および湿球温度 (WBT) および温度) に関するデータは、ICAR ヤギ中央研究所で記録されました。マフドゥーム、ファラー、マトゥラ。 THI は、次の式に従って、特定の日の乾球気温と湿球気温から計算されました。

ここで、乾球と湿球は摂氏で表した温度です。 熱ストレスのピーク期間中の最高 THI に関する生理学的反応の収集と記録は、82.00 ～ 92.08 の範囲で変化しました。 THI は、熱気候条件を予測するために使用できる可能性があります 16。 極度の熱ストレス期間では、環境温度の平均は 40.0 ～ 49.5 °C、相対湿度は 14.33 ～ 51.0 の範囲であり、動物は 28 日間、4 ～ 5 時間放射線に曝露されました。

2 つの対照的な表現型を区別するために、高呼吸数と心拍数、および低呼吸数と心拍数の分布が使用されました。 ヤギでは、呼吸活動と心拍数が熱ストレス耐性の指標として機能し、個体は熱ストレス耐性があるか、熱ストレスを受けやすいかに分類されます。 ヤギの熱ストレスの表現型分類は、他の場所で個体群レベルで広範囲に記載されています 17、18、19、20、21。

各動物からの約 3 ～ 4 ml の新鮮な血液サンプルを頸静脈穿刺によりヘパリン添加バキュテナー チューブ (BD Biosciences、フランクリン レイクス、ニュージャージー州、米国) に無菌的に収集し、RNA の単離のために直ちに冷蔵下で輸送しました。 採血中は倫理ガイドラインに従ってください。 血液サンプルをＰＢＳ、ｐＨ７．４（１：２）で希釈し、その後一定量のＨｉＳｅｐ ＬＳＭ－１０７７（Ｈｉ－Ｍｅｄｉａ）上に層状に重ねた。 血液と HiSep 培地の 2 つの層の間にきれいな界面を作り出すために、予防措置が講じられました。 サンプルを 3000 rpm、4 °C で 30 分間遠心分離し、界面からの細胞の白色不透明な単核画分を新しい微量遠心管 (MCT) に吸引しました。 ピロ炭酸ジエチル(DEPC)-リン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を加えてヤギPBMCを再懸濁し、さらに遠心分離して5000rpmで5分間洗浄した。 最後に、得られた細胞ペレットを滅菌 DEPC 処理微量遠心管に移しました。

TRIzol (Invitrogen) 法を使用して、PBMC から全 RNA を単離しました。 １ミリリットルのＴＲＩｚｏｌを再懸濁して、ＰＢＭＣペレットを溶解した。 続いて、ＲｏｕｔおよびＫａｕｓｈｉｋらに従ってＲＮＡ単離法を行った。 17、20。 RNAの質と量は、濃度にOD260を使用し、サンプルの純度を評価するために比率260/280および260/230を使用することにより、Biophotometer (Eppendorf)によって評価されました。 RNA の完全性は 1.4% アガロースゲルでテストされ、純度テスト (A280 ~ 1.9) に合格したサンプルが cDNA 合成に使用されました。 1 μgのRNAを、製造業者のプロトコールに従って転写因子第一鎖cDNA合成キット(Roche)によるcDNAの調製に使用し、このようにして得られたcDNAを将来の使用のために-70℃で保存した。 前述のように、DNase 処理は RNA から DNA 汚染を除去するために使用されました 17。 リアルタイム PCR 分析は、メーカーの指示に従って SYBR Green® マスターミックス (Roche) を使用して、Light Cycle 480 (Roche Applied Science、米国イリノイ州インディアナポリス) で実施されました。 反応は 96 ウェルプレートにセットアップし、各ウェルには 2 μL の cDNA サンプル、10 μL の SYBR グリーン I マスターミックス (Roche Applied Science、米国イリノイ州インディアナポリス)、1 μL (20 pmol) の特異的プライマーおよびヌクレアーゼフリーの水を加えて最終容量を 20 μL にします。 HSP70 遺伝子のプライマー (5' TCATCGGAGATGCAGCCAAGAA-3' および R-5' AGATCTCCTCGGGGAAGAAGGT 3') をアニーリング温度 61 °C で使用して、210 bp フラグメントを増幅しました。 GAPDH (F-5' GTGATGCTGGTGCTGAGTAC3' および R-5' GTAGAAGAGTGAGTGTCGC-3') および β-アクチン (F-5' TGCCCT GAGGCTCTCTTCCA' および R-5' TGCGGATGTCGACGTCACA-3) を使用して、HSP70 遺伝子の遺伝子発現を正規化しました。 。

熱プロファイルは、94 °C で 10 分間の初期変性、その後の 94 °C で 10 秒の変性、61 °C で 15 秒のアニーリング、および 72 °C で 20 秒の伸長の 45 サイクルとして標準化されました。 試験は二重に実施した。 PCR産物をLightcycler 480で融解曲線分析し、続いて3%アガロースゲル電気泳動を行って増幅特異性とアンプリコンサイズを確認しました。

2-ΔΔCt 法および E-method22 を使用して、標的遺伝子の発現レベルの変化倍数を測定するために相対定量を実行しました。 事前相対定量化は、Light Cycle 480 分析ソフトウェア バージョン 1.5 (Roche Applied Science、米国イリノイ州インディアナポリス) を使用した二次導関数最大値法を使用して実行されました。 すべての分析は、リアルタイム PCR で使用された 2 つのサンプル複製から計算された平均 Cp 値に基づいて実行されました。

ストレス表現型内の発現と生理学的反応が分析されました。 定数のフィッティングについては、混合モデルの最小二乗平均分析を使用して、さまざまな遺伝的および非遺伝的要因の統計的に有意な効果を決定しました23。 このモデルには、出生季節 (2 レベル)、出生型 (2 レベル)、性別 (2 レベル)、年齢 (4 レベル)、表現型 (2 レベル)、出産数 (4 レベル) および相互作用効果の固定効果が含まれています。 HSP70 遺伝子の交点 (CP) とジャムナパリ ヤギの体重をモデルの線形共変量としてフィッティングしました。

モデル 1:

ここで、Yijklmn は i 番目の出生季節、j 番目の出生型、k 番目の性別、l 番目の年齢グループ、m 番目の表現型、n 番目のパリティ、μ = 平均人口、出生季節 = i 番目の出生季節の固定効果 (2 月から 3 月) の観察です。 10 月から 11 月 = 1 と 2)、出生型 j = j 番目の出生型の固定効果 (独身と双子、J = 1 と 2)、Sexk = k 番目の性別の固定効果 (男性と女性、K = 1 と 2)、 Agel = l 番目の年齢グループの固定効果 (3 か月、9 か月、12 か月および成人 l = 1、2、3、4)、表現型 = m 番目の表現型の固定効果 (熱ストレス耐性および熱ストレス感受性) 、m = 1 および 2)、Parityn = n 番目のパリティの固定効果 (パリティ = 1 ～ 4)、Eijklmn = 平均 0 および分散 1 の観測に関連するランダム残差誤差。

すべてのサンプル収集は施設の慣行に従って行われ、研究は施設の動物倫理委員会 (IAEC/CIRG/18-19) によって承認されました。 倫理的承認プロセス中は到着基準に従いました。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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著者らは、インドのマフドゥーム、ファラー、マトゥラ、ウッタルプラデーシュ州にあるICARヤギ中央研究所所長が研究活動を実施するための施設を提供してくれたことに感謝する。

GLA 大学バイオテクノロジー学部、17Km Stone, NH-2, Mathura-Delhi Road, Chaumuhan, Mathura, 281406, UP, India

ラケシュ・カウシク & アンジャナ・ゴエル

動物遺伝学および繁殖部門、ICAR-ヤギ中央研究所、Makhdoom、Farah、Mathura、281122、UP、インド

ラケシュ・カウシク & PKルート

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RK: サンプル収集、実験室実験、qRT-PCR 実験、遺伝子発現分析、データ分析と原稿執筆に使用されるソフトウェア - レビューと編集。 AG; 原稿執筆—レビューと編集、PKR: コンセプト開発、実験計画、分析および原稿執筆—原案、レビューと編集。

ラケシュ・カウシクまたはPKルートへの対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Kaushik, R.、Goel, A. & Rout, PK 熱ストレスに応答した反芻動物の成長期における HSP70 遺伝子の発現と制御の差異。 Sci Rep 12、18310 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-22728-6

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受信日: 2022 年 4 月 18 日

受理日: 2022 年 10 月 18 日

公開日: 2022 年 10 月 31 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22728-6

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