インスリン - 江蘇ヒューマンニュートリション株式会社

Nature volume 614、pages 118–124 (2023)この記事を引用

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264 オルトメトリック

メトリクスの詳細

糖尿病は、代謝機能障害により肝臓、腎臓、末梢神経を含む複数の臓器系に損傷を与える一連の疾患です1、2。これらの併存疾患の発症と進行は、インスリン抵抗性、高血糖、脂質異常症と関連しています 3,4,5,6,7 が、異常な非必須アミノ酸 (NEAA) 代謝も糖尿病の発症に寄与しています 8,9,10。セリンとグリシンは密接に関連する NEAA であり、メタボリックシンドローム患者ではそのレベルが一貫して低下します 10、11、12、13、14 が、このメタボタイプのメカニズムの推進力と下流への影響は依然として不明です。全身性セリンおよびグリシンの低下も、黄斑神経障害および末梢神経障害の特徴として浮上しており、視力障害や末梢神経障害と相関しています 15,16。今回我々は、異常なセリン恒常性が糖尿病マウスのセリン欠乏症とグリシン欠乏症を引き起こし、セリンの取り込みと廃棄を定量化するセリン耐性試験で診断できることを実証する。若いマウスでセリンまたはグリシンの食事制限と高脂肪摂取によってこれらの代謝変化を模倣すると、脂肪蓄積を軽減しながら小繊維性神経障害の発症が著しく促進されます。栄養補助食品によるセリンの正常化とミリオシンによる脂質異常症の軽減は、どちらも糖尿病マウスの神経障害を軽減し、セリン関連末梢神経障害をスフィンゴ脂質代謝に関連付けます。これらの所見は、全身性セリン欠乏症と脂質異常症が、治療に利用できる可能性のある末梢神経障害の新たな危険因子であることを特定しています。

肥満と糖尿病がセリン、グリシン、一炭素（SGOC）代謝にどのような影響を与えるかを調べるために、確立された病的肥満、インスリン抵抗性、高血糖のマウスモデル（レプチン受容体欠損db/dbマウス）の組織全体でセリン、グリシン、メチオニンを定量しました。黒い Kaliss バックグラウンド (BKS-db/db)) で結果を比較し、年齢を一致させた野生型 C57BL/6J 対照と結果を比較しました。 db/db マウスは、野生型マウスと比較して肝臓および腎臓のセリンレベルが約 30% 減少し (図 1a および拡張データ図 1a)、より豊富なグリシンプールは肝臓で 30 ～ 50% 減少しました。、腎臓、鼠径部白色脂肪組織（iWAT）および血漿（図1aおよび拡張データ図1a〜c）。メチオニンは一炭素代謝を通じてセリンと結びついており、肝臓、iWAT、血漿でも減少していました（図1aおよび拡張データ図1b、c）。これは、糖尿病がグルコースにとって重要な組織内のセリンおよびグリシンレベルを低下させることを示唆しています。そして脂質の恒常性。

a、6時間絶食後の野生型マウスおよびBKS-db/dbマウスの肝臓におけるグリシン、セリン、およびメチオニンのレベル（グループあたりn = 6）。 b. セリンとグリシンの生合成経路と異化経路の概略図。 BKS-db/db マウスで上方制御された肝臓遺伝子は紫色で、下方制御された遺伝子は青色で表示されます。 10-ホルミルTHF、10-ホルミルテトラヒドロ葉酸; 3-PG、3-ホスホグリセリン酸; 5,10-meTHF、5,10-メチレンテトラヒドロ葉酸; dTMP、デオキシチミジン一リン酸。 f-Met、N-ホルミルメチオニン。 PEP、ホスホエノールピルビン酸塩; TCA、トリカルボン酸。 THF、テトラヒドロ葉酸。 c、野生型マウスおよびBKS-db/dbマウスにおけるSGOC代謝を調節する肝酵素遺伝子のmRNA発現（各グループn = 6）。 d、一晩絶食した後、強制経口投与により[U-13C3]セリンを投与された野生型マウスにおける血漿セリン、グルコース、グリシンおよびメチオニン標識画分（1 − M0）（時点当たりn = 4）。 e、一晩絶食させた後、強制経口投与による[U-13C3]セリン投与15分後の野生型マウスにおける組織グリシン標識画分（組織あたりn = 4）。 f、一晩絶食後の野生型マウスにおける経口強制経口投与による[U-13C3]セリン投与15分後の組織ピルビン酸標識画分（組織あたりn = 4）。 g、一晩絶食後の野生型マウスおよびBKS-db/dbマウス（グループあたりn = 6）におけるOGTTおよびSTTの組み合わせ。 h、野生型およびBKS-db/dbマウスにおけるSTT AUC（グループあたりn = 6）。ｉ、一晩絶食後のビヒクル処置（ｎ＝７）およびＳＴＺ処置（ｎ＝６）Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＯＧＴＴおよびＳＴＴの組み合わせ。 j、ビヒクル処理 (n = 7) および STZ 処理 (n = 6) C57BL/6J マウスにおける STT AUC。データは平均値±標準誤差であり、両側独立t検定（a、c、h、j）およびフィッシャーの最小有意差事後検定（g、i）による二元配置分散分析を使用して分析されました。図 1b の回路図は BioRender で作成されました。

哺乳類は食事からセリンを摂取し、グルコースからグリシンおよび一炭素代謝を介して新規合成し、肝臓と腎臓が食後のNEAA代謝の主要部位として機能します（図1b）。 db/db マウスにおける肝臓のセリンとグリシンの減少のメカニズムの基礎をよりよく理解するために、6 時間の絶食後の SGOC 代謝に関連する遺伝子の発現を定量しました（図 1c）。セリンデヒドラターゼ (Sds)、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ 1 (Shmt1)、Shmt2、および 10-ホルミルテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ (Aldh1l1) など、セリンおよび 1 炭素単位の異化または廃棄に関与する主要な酵素をコードする遺伝子が、db/db マウスで大幅に上方制御されていました。グリシン切断システムの構成要素をコードする 2 つの遺伝子、グリシンデカルボキシラーゼ (Gldc) とジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ (Dld) の発現は db/db 肝臓で増加しましたが、3-ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ (Phgdh) とメチレンテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ 2 (Mthfd2) の発現は増加しました。 ) は両方とも大幅に減少し、糖尿病マウスでは新規セリン合成も制限されている可能性があることを示しています。これらの結果は、ヒト糖尿病肝臓からの転写データのゲノムスケールの代謝モデリングと一致しています17。腎臓は SGOC 代謝のもう 1 つの中心であり 18、腎臓における Shmt1 および一炭素代謝に関連する酵素をコードするいくつかの遺伝子の発現が db/db マウスで増加しました（拡張データ図 1d）。

アミノ酸とグルコースの日内変動および食後変動により、代謝異常の診断が困難になります。したがって、我々は、「セリン耐性試験」(STT) がマウスの SGOC 代謝をより適切に評価し、セリン処理が上昇しているマウスを特定できるのではないかという仮説を立てました。ヒトの臨床試験 (ClinicalTrials.gov: NCT03062449) (400 mg kg-1) で使用されたものと同様の用量を適用して、一晩絶食させた野生型マウスにセリンを経口投与し、セリンクリアランスの動態を測定するために血漿セリン薬物動態を定量化しました。レベルは約 2 時間でベースラインに戻ります (拡張データ図 1e)。セリン処理に関与する主要な経路を特定するために、一晩絶食させた野生型マウスに[U-13C3]セリンを経口投与し、下流の代謝産物の濃縮を定量しました。テスト全体を通じてグルコースがグリシンと同程度に標識され（図1d）、[U-13C3]セリン由来の炭素が肝臓のグリシン、ピルビン酸、およびクエン酸のプールに大幅に取り込まれたことが観察されました（図1e、fおよび拡張）データ図1f、g）は、肝臓の糖新生が、状況によってはセリン処理の主要な経路であることを示しており、その制御をインスリンとグルカゴンに関連付けており、どちらもdb / dbマウスで上昇しています（拡張データ図2a〜c）。インスリン抵抗性がセリンの吸収と廃棄に影響を与えるかどうかをテストするために、一晩絶食させた野生型マウスとdb/dbマウスにグルコース（2 g kg-1）とセリン（400 mg kg-1）の両方を投与しました。より高い用量を投与したにもかかわらず、db/dbマウスのSTT曲線下面積（AUC）の有意な減少が観察されました（図1g、hおよび拡張データ図2d）。注目すべきことに、急速な相互変換の証拠があるにもかかわらず（図1d、e）、急性セリンチャレンジは循環グリシン濃度に本質的に影響を与えませんでした（拡張データ図2e）。逆に、セリンをグルコースなしで投与した場合、野生型マウスとdb/dbマウスの間でSTT AUCに差はありませんでした（拡張データ図2f）。

セリン処理の亢進がレプチン受容体欠損db/dbマウスに特有のものであるのか、それともより一般的にインスリンシグナル伝達障害に起因するのかを判断するために、我々はC57BL/6Jマウスをビヒクルまたはストレプトゾトシン（STZ）で処理してインスリン欠乏、高血糖および脂肪減少を誘発した（拡張データ図 2g–i)。血漿グリシンおよび分枝鎖アミノ酸（セリンは除く）は、STZ処理の1週間後に変化しました（拡張データ図2j）。注射の2週間後、グルコースとセリンの同時投与により、対照と比較してSTZ糖尿病マウスのセリン処理の上昇が明らかになり（図1i、jおよび拡張データ図2k）、インスリン抵抗性または欠乏の両方が循環血液量の減少に寄与している可能性があることを示唆しています糖尿病マウスのセリン。

臨床研究では、セリン欠乏が黄斑疾患および末梢神経障害の制御に関与していることが示されています 15,16。 db/db マウスのセリン恒常性の障害を考慮して、次に、このモデルでは異常なセリン代謝が末梢神経障害と同時に発生することを確認しました。 14週齢のdb / dbマウスは、熱性および触覚の鈍痛、ならびに運動神経伝導速度（MNCV）の低下を示しました（拡張データ図2l〜n）。これらの所見は、異常なセリン恒常性が糖尿病性末梢神経障害に関連していることを示唆しています。

セリンおよびグリシンの制限は、マウスの健康転帰を調節するために広く使用されており、数か月間は比較的よく耐えられます 16、19、20、21、22。食餌誘発性肥満に関連した全身性セリン欠乏の影響をモデル化するために、マウスに低脂肪食（10％ kcal）（LFD）または高脂肪食（60％ kcal 脂肪）（HFD）を与え、それらの表現型を比較しました。セリンとグリシンを欠く等窒素食餌（-SG LFDまたは-SG HFD）を与えられたマウスに与えた（補足表1）。両方の-SG食は、摂食状態では循環および肝臓のセリンおよびグリシン含有量を効果的に減少させましたが、絶食状態では減少させませんでした（図2a、bおよび拡張データ図3a、b）。 HFD 単独でも肝臓のグリシンレベルは低下しましたが、その程度は食事からのセリンおよびグリシンの中止よりも低かった (拡張データ図 3b)。グルタチオンを含む他のセリンおよびグリシン由来の肝臓代謝産物は、それらの制限によって強い影響を受けませんでした（拡張データ図 3b）。注目すべきことに、HFDによって引き起こされる体重増加は食事のセリンとグリシンの制限によって軽減されましたが、食事、カロリーと水の摂取量、カロリー吸収、身体活動はすべて影響を受けませんでした（図2cおよび拡張データ図3c–h）。エコー磁気共鳴画像法（echoMRI）を使用して、すべてのグループの除脂肪量と脂肪量を定量化し、食事性セリン制限により脂肪量が大幅に減少したが、HFDグループと比較して除脂肪量には影響がなかったことが観察されました（図2d）。これらの脂肪蓄積の変化と一致して、HFD摂食が増加する一方で、セリンおよびグリシン制限が減少し、精巣上体白色脂肪細胞サイズが減少することが観察されました（拡張データ図3i）。

a、LFD、-SG LFD、HFD、または-SG HFDを18週間給餌した給餌マウスおよび一晩絶食マウスにおける血漿セリンレベル（各群n = 10）。 b、LFD、-SG LFD、HFD、または-SG HFDを18週間与えられたマウスの血漿グリシンレベル（各グループn = 10）。 c、LFD、-SG LFD、HFD、または-SG HFDを与えられたマウスの体重（グループあたり n = 13）。 d、LFD（n = 10）、-SG LFD（n = 12）、HFD（n = 13）または-SG HFD（n = 13）を給餌してから18週間後のマウスの体組成。 e、LFD、-SG LFD、HFD、または-SG HFDを与えてから18週間後の耐糖能試験（GTT）AUC（グループあたりn = 13）。 f、LFD、-SG LFD、HFD、または-SG HFDを与えてから18週間後のインスリン負荷試験（ITT）AUC（グループあたりn = 15）。 g、LFD、-SG LFD、HFD、または-SG HFDを与えられたマウスにおける系統学的アルファ多様性（グループあたり n = 10）。 h、LFD（n = 10）、-SG LFD（n = 10）、HFD（n = 9）または-SG HFD（n = 9）を18週間与えられたマウスにおける脂肪酸合成経路からの種の対数分率。 i、LFD（n = 3）、-SG LFD（n = 4）、HFD（n = 5）または-SG HFD（n = 5）を18週間与えられたマウスにおける肝臓の新規パルミチン酸合成。 j、LFD（n = 15）、-SG LFD（n = 15）、HFD（n = 14）または-SG HFD（グループあたりn = 15）を与えられたマウスにおける熱感知。データは平均値±標準誤差、最小値と最大値（g、h）であり、フィッシャーの最小有意差事後検定（a-j）を備えた二元配置分散分析を使用して分析されました。

-SG HFD の給餌がグルコース恒常性にどのような影響を与えるかを決定するために、標準的な GTT および ITT を使用してマウスを分析しました。 −SG HFDは肥満を軽減しましたが、マウスは耐糖能およびインスリン不耐症のままでした（図2e、fおよび拡張データ図3j、k）。これは、セリンおよびグリシンの制限とその結果としての肥満の減少がHFD誘発性耐糖能異常を妨げないことを示唆していますそしてインスリン抵抗性。脂質よりも炭水化物の全身性基質利用の変化が肥満の変化を引き起こしているかどうかをテストするために、各食餌を摂取したマウスを18週間代謝ケージに入れ、呼吸交換比（RER）を定量化しました。 HFD は予想どおり RER を変化させましたが、食事のセリン/グリシン制限では変化は観察されませんでした (拡張データ図 3l)。

次に、我々は、上記の食事がマイクロバイオームの構成と多様性にどのような影響を与えたかを理解するために、糞便微生物叢のメタゲノム分析を実行しました。これらは、食事の欠乏と相関し、それを緩和することができます23。持続的なHFDまたは-SG HFD給餌は、LFD給餌マウスと比較して系統発生的アルファ多様性を減少させましたが、-SG LFD給餌はアルファ多様性を増加させました（図2g）。逆に、堅牢な主成分分析からのアイチソン距離のPERMANOVAテストでは、-SG HFDを与えたマウスと他のグループの間のベータ多様性の有意な違いが明らかになり、この低炭水化物、高脂肪、セリンおよびグリシン制限食の明確な効果が強調されています。糞便マイクロバイオーム (拡張データ図 4a)。さらに、完全なセリン生合成経路とグリシン切断経路を発現する微生物株の対数比は、-SG HFDによってそれぞれ増加および減少しました（拡張データ図4b、c）。この食餌は完全なセリン生合成経路を発現する微生物株の対数比を減少させました。脂肪酸合成経路（図２ｈ）。最も強い変化を示す主要な株を拡張データ図 4d にリストします。注目すべきことに、-SG LFDの給餌はこのように株を調節しなかったが、これはおそらく、セリン合成を促進する可能性のある炭水化物含有量がより高いためであると考えられる。

次に、セリン欠乏が肝臓の脂肪生成にどのような影響を与えるかを直接調査するために、上記の食餌を 18 週間与えたマウスに重水 (D2O) を 18 時間投与し、同位体濃縮、モル存在量、および合成の定量化のために脂質を抽出しました 24。食事によるセリンおよびグリシンの制限は、セリンが豊富な対照食と比較して、肝臓のパルミチン酸合成を約70％強力に減少させた（図2iおよび拡張データ図5a）。肝臓のコレステロール合成は、HFDと比較して-SG HFDで増加しました（拡張データ図5b）。これらの変化と一致して、ATP-クエン酸リアーゼ (ACLY)、アセチル-CoA カルボキシラーゼ (ACC2) およびステアロイル-CoA デサチュラーゼ (SCD1) の肝臓発現は食事性セリン制限により大幅に (約 50%) 減少しましたが、コレステロール生合成の発現は減少しました。酵素は変化しないか増加しました (拡張データ図 5c–e)。 Ser473およびThr308におけるAKTのリン酸化の変化は、セリンおよびグリシンのレベルではなく、食事の脂肪および炭水化物含有量と相関しており、セリン制限がインスリンシグナル伝達とは独立した脂肪酸代謝の変化を引き起こすことをさらに示唆しています（拡張データ図5c）。

全身性セリン欠乏は、最近、さまざまな神経変性疾患と関連付けられています 16、25、26、27、28。したがって、セリン処理量が増加している糖尿病患者は、セリン関連末梢神経障害を思わせる神経学的併存疾患にかかりやすい可能性があります。長期にわたる慢性セリン欠乏が末梢神経障害を引き起こすのに十分であるかどうかを判断するために、マウスに対照食またはセリンおよびグリシンを含まない固形飼料（エネルギーの19.2％が脂肪によるもの）を最大12か月間与えました。熱に対する熱反応の時間的定量化により、食事介入の 12 か月後に痛覚鈍麻への進行が明らかになりました (拡張データ図 6a)。これは以前の観察と一致しています 16。この時点で、足の皮膚の表皮内神経線維（IENF）密度の低下も検出しました（拡張データ図6b）。これは、小さな感覚線維変性の臨床尺度でもあります29。注目すべきことに、わずか3か月間-SG HFDを与えたマウスは顕著な熱性痛覚鈍麻を示し（図2j）、低全身セリンとHFDの組み合わせがマウスの末梢神経障害の発症を促進することを示しています。

セリンは、神経系に豊富に含まれる標準的なスフィンゴ脂質の生合成に不可欠です。セリンが制限されると、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ (SPT) がアラニンを含む他のアミノ酸を取り込んで、非標準的なデオキシスフィンゴ脂質を形成します 30,31。肥満と神経障害における標準セラミドと 1-デオキシ(ジヒドロ) セラミドの重要性をそれぞれ考慮して 15,32、我々は、SPT 阻害が観察された肥満と神経障害の表現型に影響を与える可能性があると仮説を立てました。したがって、我々は、上記の食事を6か月間与えたマウスにSPTの阻害剤であるミリオシン(1日おきに0.3 mg kg-1)、またはビヒクルを投与し、スフィンゴ脂質の多様性と熱感知を定量化した。以前の報告32と一致して、ミリオシン治療は、血漿セリンおよびグリシンレベルに影響を与えることなく、HFD誘発性の体重増加を軽減しました（拡張データ図6c〜f）。ただし、ミリオシンは、-SG HFDを与えられたマウスによって示される熱性痛覚鈍麻も軽減しました（図3a）。 SPT 活性の低下によりセリン関連の末梢神経障害が軽減されることがわかりました。

a、LFD ＋ビヒクル（veh）（n = 10）、LFD ＋ 0.3 mg kg-1 ミリオシン（myr）（n = 10）、−SG LFD ＋ビヒクル（n = 10）、−SG を与えられたマウスにおける熱潜伏時間LFD プラスミリオシン (n = 9)、HFD プラスビヒクル (n = 10)、HFD プラスミリオシン (n = 10)、−SG HFD プラスビヒクル (n = 10)、または−SG HFD プラスミリオシン (n = 9)。 b、LFDプラスビヒクル（n = 10）、LFDプラスミリオシン（n = 10）、−SG LFDプラスビヒクル（n = 10）、−SG LFDプラスミリオシン（n = 9）を与えられたマウスにおける肝臓デオキシDHCerのスタックプロット、ＨＦＤ＋ビヒクル（ｎ＝１０）、ＨＦＤ＋ミリオシン（ｎ＝１０）、−ＳＧＨＦＤ＋ビヒクル（ｎ＝１０）、または−ＳＧＨＦＤ＋ミリオシン（ｎ＝９）。 c、LFDプラスビヒクル（n = 12）、HFDプラスビヒクル（n = 12）、-SG HFDプラスビヒクル（n = 12）、または-SG HFDプラスミリオシン（n = 11）を与えられたマウスにおける熱潜伏時間経過。 d、LFDプラスビヒクル（n = 10）、HFDプラスビヒクル（n = 7）、-SG HFDプラスビヒクル（n = 12）または-SG HFDプラスミリオシン（n = 8）を与えられたマウスにおけるIENF密度。 e、LFDプラスビヒクル（n = 12）、HFDプラスビヒクル（n = 12）、-SG HFDプラスビヒクル（n = 12）または-SG HFDプラスミリオシン（n = 11）を与えられたマウスにおける足皮膚デオキシDHCer分布。データは平均±標準誤差であり、フィッシャーの最小有意差事後検定を使用した一元配置分散分析 (a、b、d、e) またはフィッシャーの最小有意差事後検定を使用した二元配置分散分析 (c) を使用して分析されました。 b、eの統計分析は、デオキシDHCer存在量の合計を使用して実行されました。

この末梢神経障害表現型の代謝ドライバーをより深く理解するために、次に肝臓と坐骨神経のセラミドとデオキシジヒドロセラミド (デオキシDHCer) を定量しました。セリンとグリシンを制限すると、LFDおよびHFD設定でデオキシDHCerが増加し、HFDバックグラウンドで標準セラミドが減少しましたが、ミリオシンは一般にスフィンゴ脂質の量を減少させました（図3bおよび拡張データ図6g–i）。対照的に、セラミドおよび1-デオキシスフィンゴ脂質のレベルは変化しないか、坐骨神経の末梢神経障害表現型と相関しなかったが、これは潜在的にミエリンに存在する大きな脂質沈着によるものである（拡張データ図6h、i）。注目すべきことに、LFDバックグラウンドでのセリン制限は6か月後でも熱性痛覚鈍麻を誘発しなかった（図3a）。これは、1-デオキシスフィンゴ脂質の蓄積だけではこの表現型を駆動するには不十分であることを示しており、Sptlc1C133Wマウスモデルの最近の報告と一致している33。次に、LFD、HFD、-SG HFD、または-SG HFDとミリオシンを6か月間与えたマウスの別のコホートでIENF密度、角膜神経密度、組織脂質を測定しました。ミリオシンは、-SG HFDを与えられたマウスの熱性痛覚鈍麻の発症を軽減し（図3c）、この治療は触覚感覚に影響を与えることなく、表皮と角膜の小線維神経密度も保護しました（図3dおよび拡張データ図7a、b）。またはMNCV（拡張データ図7c、d）は、この早期発症表現型がスフィンゴ脂質代謝の他のノードとは対照的に、小さな感覚線維と1-デオキシスフィンゴ脂質に特異的であることを示唆しています34。 -SG HFDを与えられたマウスは肝臓の1-デオキシスフィンゴ脂質とスフィンゴミエリンの増加を示しましたが、ミリオシンはスフィンゴ脂質、トリグリセリド、ジアシルグリセリドのレベルを大幅に低下させ（拡張データ図7e）、リピドームに対するこの分子の多面発現効果をさらに強調しています32、35。最後に、足の皮膚は、ミリオシン処理で減少したデオキシDHCerの大幅な増加を示し（図3e）、小線維を囲む脂質微小環境が感覚機能に影響を与える可能性があることを示唆しています。

次に、SPT活性を抑制することで、循環デオキシSAが増加し、肝臓セラミドとデオキシDHCerが増加したdb / dbマウスの神経障害を軽減できるかどうかを評価しました（拡張データ図8a、b）。 −SG HFD食誘発性末梢神経障害モデルの結果と一致して、生後6週目にミリオシンを投与すると、db/dbマウスの温熱性痛覚鈍麻への進行が防止され、触覚が回復した（拡張データ図8c、d）。 IENF密度は、ミリオシンを8週間投与したdb/dbマウスでも増加しました（拡張データ図8e）。ミリオシンは体重増加、高血糖、血漿セリンレベルには影響しませんでしたが（拡張データ図8f-h）、肝臓の標準スフィンゴ脂質を大幅に減少させましたが、足の皮膚の1-デオキシスフィンゴ脂質とセラミドには限定的な効果を示しました（拡張データ図8i） –n)。したがって、ミリオシンはおそらく、肝臓および他の組織を標的とする直接的および間接的なメカニズムを通じて作用し、それがその毒性の原因でもある 35 。

糖尿病マウスが示す慢性セリン欠乏を考慮して、次に、db/db マウスに生後 6 週目から 3% セリン強化食を与え、神経障害の表現型を定量化しました。熱感覚は生後6、10、14週目に測定され、触覚は屠殺時に測定され、その時点でマウスの血漿および肝臓セリンレベルの上昇は示されましたが、グリシンレベルの上昇は示されませんでした（図4a、b）。このコホートでは体重の変化は観察されず、循環グルコースレベルのわずかな増加が観察されました（拡張データ図9a、b）。しかし、このセリン豊富な食事を与えられたマウスでは、熱痛覚鈍麻と触覚鈍痛の両方が減少しました（図4c、d）。注目すべきことに、標準スフィンゴ脂質の変化は組織全体で観察されませんでしたが、1-デオキシスフィンゴ脂質は肝臓と足の皮膚の両方で大幅に減少しました（図4e、fおよび拡張データ図9c-f）。総合すると、これらのデータは、セリンの補給により糖尿病性末梢神経障害の進行を遅らせることができることを示唆しています。

a、コントロール (n = 8) またはセリン添加食 (n = 9) を 8 週間給餌した BKS-db/db マウスの給餌状態での血漿アミノ酸レベル。 b、対照食またはセリン添加食のいずれかを8週間給餌したBKS-db/dbマウスの給餌状態での肝臓アミノ酸含有量（各グループn = 8）。 c、対照（n = 8）またはセリン添加食（n = 9）のいずれかを与えられたBKS-db/dbマウスにおける熱潜伏時間の経過。 d, BKS-db/db マウスに対照 (n = 8) またはセリン添加食 (n = 9) を与えてから 8 週間後の触覚センシング。 e, 対照食またはセリン添加食のいずれかを8週間与えられたBKS-db/dbマウスの肝臓におけるデオキシDHCerのレベル(各群n = 8)。 f、対照食またはセリンを添加した食餌を8週間与えたBKS-db/dbマウスの足皮膚におけるデオキシDHCerのレベル（各群n = 8）。データは平均±標準誤差であり、両側独立t検定（a、b、d–f）またはフィッシャーの最小有意差事後検定を備えた二元配置分散分析（c）を使用して分析されました。 e、fの統計分析は、デオキシDHCer存在量の合計を使用して実行されました。

ここでは、慢性的な全身性セリン欠乏症の直接的または間接的な誘導がどのように脂質恒常性を変化させ、糖尿病性末梢神経障害に寄与するかを説明します。ミリオシンまたはセリン補給による 1-デオキシスフィンゴ脂質生合成による脂質異常症の調節は、肥満糖尿病マウスの熱痛覚鈍麻と触覚鈍痛の両方を軽減します。これらの結果は、セリン欠乏症が脂質異常症と相乗して、希少疾患の状況 16,25,26 と、一部の人々が経験する併存疾患として現れる 2 型糖尿病などの広範な慢性疾患を介して間接的に神経学的表現型をどのように変化させることができるかを浮き彫りにしています。患者。糖尿病マウスにおける循環セリンとグリシンの減少は、糖新生、一炭素代謝、腎滞留 18,36 および/またはアシルグリシンとしての廃棄 37 による流動の増加によって引き起こされる可能性があり、これらは脂質異常症 38 の影響も受けます。

STT は、経口ブドウ糖負荷試験 (OGTT) に類似しており、食後のセリン処理量の増加を示し、特に感覚神経障害を起こしやすい可能性のある患者を特定できます。栄養補助食品によって循環セリンレベルを正常化すると、db/db マウスの感覚神経障害の発症と進行が遅延します。実際、セリンとビタミン B の補給は一部の前臨床モデルで末梢神経障害を改善し、さまざまな神経変性疾患の臨床試験の焦点となっています 39,40,41 (ClinicalTrials.gov: NCT03062449)。我々の結果は、セリンとグリシンの恒常性、スフィンゴ脂質の代謝、および糖尿病の併存疾患の間の生理学的に関連する分子の関連性を強調しています。糖尿病および肥満のマウスモデルの代謝および神経障害表現型は系統および遺伝子型によって異なります 42、43、および C57BL6/J マウスは、Nnt44 およびその他の遺伝子の変異により、HFD の代謝の影響に特に敏感です。しかし、糖尿病db/dbマウスと-SG HFDを与えたC57BL/6Jマウスの両方における我々のデータは、脂質異常症と組み合わされたセリン欠乏が、異なる遺伝的背景において末梢神経障害を引き起こす可能性があることを実証している。

セリンとグリシンの欠乏がなぜ肝臓の脂肪酸合成や肝臓での遺伝子発現を抑制するのかなど、いくつかの重要な疑問が残っている。さらに、多様なスフィンゴ脂質種および/またはその誤った局在は神経障害の一因となります 21,45,46,47,48 が、それらの正確な毒性メカニズムは依然として不明です。私たちは、3 か月で表現型を発現するセリン関連感覚神経障害の食事モデルを開発および検証しました。これは、神経毒性脂質異常症をどのように管理できるかを理解するのに役立ちます。一般的な一塩基多型やまれなコード事象など、多様な遺伝的変化が循環するセリンとグリシンに影響を与える可能性があります25、28、49。または、そのような欠損は、糖尿病によって誘発される再配線された肝代謝によって誘発される可能性があります。したがって、スフィンゴ脂質の多様性の変化と、栄養脂質過負荷に対処する肝臓の能力の低下の両方において、全身性セリン欠乏は、加齢および糖尿病に関連する神経障害の修飾因子として現れる。

すべてのマウス実験は、カリフォルニア大学サンディエゴ校の動物管理使用委員会 (IACUC) およびソーク生物学研究所に従って承認され、実施されました。マウスは同じ温度（21℃）、湿度（周囲湿度65％）、および12時間の明暗サイクル（06:00～18:00）に確実に曝されるように同じ部屋に飼育されました。図 1 では、14 ～ 16 週齢の C57BL/6J (JAX 000664) または BKS-db/db マウス (JAX 000642)、および 10 ～ 12 週齢のビヒクルまたは STZ で処理した C57BL/6J (JAX 000664) マウスは組織採取前に 6 時間絶食させました。動物をイソフルランで麻酔し、首を切り、液体窒素の温度に予冷したウォレンバーガークランプを使用して組織を迅速に収集し、分析まで-80℃で保存しました。図 2 では、生後 8 週間の C57BL/6J (JAX 000664) に Envigo から入手した飼料を与えました。食事組成の詳細は補足表1に記載されています。食事実験では、組織は07:00〜10:00の間、つまり、特に明記されていない限り、摂食状態で収集されました。別の動物コホートから、摂食（07:00 ～ 10:00 時間）および絶食（18 時間一晩絶食）状態での食事介入の 18 週間後に血漿サンプルを収集しました。 db/db マウスの実験では、6 時間の絶食後に組織を収集しました。図 3 では、生後 8 週間の C57BL/6J (JAX 000664) に Envigo から入手した飼料を与えました。組織採取は07:00～10:00の間に行われた。動物をイソフルランで麻酔し、首を切り、液体窒素の温度に予冷したウォレンバーガークランプを使用して組織を迅速に収集し、分析まで-80℃で保存しました。図 4 では、6 週齢の BKS-db/db マウス (JAX 000642) に、対照食またはセリン添加食 (Envigo 提供) を 8 週間与えました。特に明記しない限り、組織収集は07:00〜10:00の間に行われました。動物をイソフルランで麻酔し、断頭し、液体窒素の温度に予冷したウォレンバーガークランプを使用して組織を迅速に収集し、分析まで-80℃で保存した。

年齢を合わせた14～16週齢の野生型マウスとBKS-db/dbマウス、および10～12週齢のビヒクル処理マウスとSTZ処理C57BL/6J（JAX 000664）マウスを、水を与えて一晩絶食させた自由に提供されました。 STT では、動物の体重を量り、セリンおよび/またはグルコースをそれぞれ 400 mg kg-1 および 2 g kg-1 の用量で強制経口投与し、尾端の血液サンプルを EDTA でコーティングされたマイクロベットチューブに収集しました ( Sarstedt) 強制経口投与前、および強制経口投与の 15、30、60、120、180 分後。 EDTA マイクロベットを 2,000 g、4 °C で 5 分間回転させて血漿を取得し、サンプルを分析まで -80 °C で保存しました。血中グルコース濃度とセリン濃度は、以下に説明するように、それぞれ Contour Next glucometer (Bayer) とガスクロマトグラフィー質量分析法を使用して定量しました。 PKソルバー50を使用して、400mg kg-1用量の血漿セリン薬物動態を測定した。

セリンの下流運命を評価するために、野生型マウスを一晩絶食させ、朝体重を測定し、組織を採取し、Wollenberger クランプを使用して [U-13C3]セリンを 400 mg kg-1 の用量で強制経口投与しました。強制経口投与前および経口強制経口投与の 15、30、45、60、および 120 分後に液体窒素の温度に冷却し、分析までサンプルを -80 °C で保存しました。

市販のキットを使用して、製造業者の指示に従ってマウスを6時間絶食させた後の血清インスリン(マウスインスリンELISA 10-1247-01、Mercodia)およびグルカゴン(Glucagon ELISA 10-1271-01、Mercodia)を測定した。

18週間食餌を与えたC57BL/6Jマウスに、体重1g当たり0.027mlの用量でD2O（0.9％NaCl中）を腹腔内注射し、飲料水を6％D2O富化溶液に置き換えて約18時間投与した。朝（07:00〜10:00）に、液体窒素の温度に予冷したWollenbergerクランプを使用して組織を迅速に収集し、分析まで-80°Cで保存しました。

血漿 D2O 濃縮は、前述のように重水素 - アセトン交換プロトコルを使用して決定されました 24。簡単に説明すると、5 μl の血漿を 4 μl の 5% アセトンのアセトニトリル溶液および 4 μl の 10 M NaOH とともに 24 時間インキュベートしました。次に、500 mg の Na2SO4 と 600 μl のクロロホルムを加え、サンプルをボルテックス混合しました。 3,000 g で 2 分間遠心分離した後、80 μl を 3 回ずつガスクロマトグラフィー質量分析 (GC-MS) バイアルに移し、Agilent DB-35MS カラム (30 m x 0.25) の外部標準曲線から血漿 D2O 濃縮を定量しました。 mm 内径 × 0.25 μm、Agilent J&W Scientific) を、以下の温度プログラムで Agilent 5975 C 質量分析計と接続された Agilent 7890 A ガスクロマトグラフ (GC) に取り付けました: 初期温度 60 °C、毎分 20 °C ずつ上昇100 °C、毎分 50 °C ずつ上昇させて 220 °C まで上昇させ、1 分間保持します。

組織の D2O 標識を定量化するために、約 20 mg の凍結組織を、内部標準パルミチン酸 d31 (Cambridge Isotope Laboratories、DLM) を添加した 250 μl -20 °C のメタノール、250 μl の氷冷生理食塩水、および 500 μl -20 °C のクロロホルムでホモジナイズしました。 -215-PK) およびコプロスタノール (Sigma、7578)。 4℃、21,000gで5分間遠心した後、クロロホルム画分を収集し、乾燥させ、メタノール中の2% H2SO4 500μlを用いて50℃で2時間再懸濁した。次に、100 μl の飽和 NaCl と 500 μl のヘキサンを加え、サンプルをボルテックス混合し、上部のヘキサン相を収集して GC-MS バイアルに移しました。脂肪酸メチルエステルは、Agilent 5975 C MS と接続された Agilent 7890 A GC に取り付けられた Select FAME カラム (100 m × 内径 0.25 mm) を使用し、以下の温度プログラムを使用して分析されました: 初期 80 °C、20 °C ずつ上昇min-1 から 170 °C まで、min-1 から 1 °C ずつ上昇して 204 °C になり、次に 20 °C min-1 から 250 °C まで上昇し、10 分間保持します。各脂肪酸および極性代謝物のアイソトポローグ分布パーセントは、以前のレポートから適応された社内アルゴリズムを使用して決定され、自然存在量に合わせて補正されました51。

GTT および ITT では、18 週間食餌を与えた C57BL/6J マウスを一晩絶食させ、水を自由に与えました。朝、動物の体重を量り、Contour Next glucometer (Bayer) を使用して尾の出血から空腹時血糖を測定した。 GTT の場合、動物に体重 2 g kg-1 の用量でグルコースをボーラス腹腔内注射し、注射後 15、30、60、120 および 180 分で血糖を測定しました。 ITTの場合、動物にインスリン（100 IU ml-1のフムリンインスリン、Eli Lilly）を0.5 IU kg-1の用量で腹腔内注射し、15、30、60および90分後に血糖を定量した。 - 前述の注射52。

除脂肪量と脂肪量は、EchoMRI 3-in-1 装置 (定量的核磁気共鳴 (qNMR) イメージングシステム) を使用して測定されました。包括的実験動物モニタリングシステム (CLAMS) (Oxymax、Columbus Instruments) を使用して、6 日間の個別飼育マウスの全身代謝率を定量化しました。水、餌、およびカロリー摂取量は、CLAMS に曝露された 6 日間にわたる個別に飼育された動物から計算されました。全身の酸素消費量 (VO2) と二酸化炭素 (VCO2) の割合を対応する総体重に正規化し、RER を VCO2 と VO2 の比として計算しました。

約 1 g の糞便を一晩乾燥させ、乳鉢と乳棒を使用して粉砕しました。粉末サンプルを 300 μl ddH2O でペレットに戻し、重量を量りました。ペレットを、２，０００ｍｌのｄｄＨ２Ｏ（Ｐａｒｒ６１００ＣｏｍｐｅｎｓａｔｅｄＪａｃｋｅｔＣａｌｏｒｉｍｅｔｅｒ）に囲まれたボンベシリンダー内に置いた。燃焼によって発生する熱は水温の変化によって測定されました。熱量計のエネルギー当量 W (Cal °C-1) は、標準化された安息香酸を使用して計算されました。各ペレットの最終エネルギー含有量は次のように計算されました。

カロリー吸収は、カロリー摂取量から総エネルギー（糞便カロリー抽出）を差し引くことによって計算されました。

MoBio PowerFecal DNA 分離キット (12830-50) を使用して、10 ～ 30 mg の便から DNA を抽出しました。抽出された DNA は、Nanodrop (ThermoFisher Scientific) を使用して定量されました。全ゲノムシーケンスの生データは Qiita53 にアップロードされ、そこでデフォルトの処理ワークフローに従いました。要約すると、生の読み取りは、fastp バージョン 2054 の自動検出パラメーターを使用してアダプターでフィルター処理され、ホスト (マウス) は minimap2 バージョン 2.1755 を使用してフィルター処理されました。結果として得られた配列は、Bowtie 2 バージョン 2.4.256 を使用して、Web of Life Toolkit アプリ (https://github.com/qiyunzhu/woltka) 経由で Web of Life (WoL) 参照データベース 57 にアライメントされました。このステップでは、属、種、ゲノムごと、および遺伝子ごとのテーブルが生成されました。すべての分析で、ゲノムごとのテーブルを使用しました。次に、アルファ多様性についてはサンプルあたり 1,273,062 配列未満のサンプルを削除し、ベータ多様性分析については同じ値で希少化しました。ダウンストリーム分析は QIIME 2 バージョン 2020.1158 で実行されました。全体的な微生物叢の変化を評価するために、Faith PD59 を通じてアルファ多様性分析が実行され、ロバスト主成分分析 (RPCA) を通じてベータ多様性分析が実行され 60、結果として得られた Aitchison 距離が順列多変量分散分析 (PERMANOVA) を通じて評価されました 61。

次に、固定効果として食事の種類を、ランダム効果としてケージを組み込んだ、差分存在量のベイジアン階層モデルを設計しました。過分散を考慮して、カウント生成プロセスを負の二項分布としてモデル化します。マイクロバイオームデータがまばらであるため、カウント生成プロセスとは別に各微生物に観察されない確率を割り当てることで、ゼロインフレも考慮しました。

このモデルは Stan 確率的プログラミング言語 62 を使用して作成し、BIRDMan (https://github.com/gibsramen/BIRDMAn) を使用してモデルを適合させました。組成性を説明するために、表の最初の微生物を追加の対数比参照として使用してこのモデルをフィッティングし、フィッティング後に対数倍率変化を中心対数比座標に変換しました。ターゲットパラメータの事前分布として以下を使用しました。

ここで、i はサンプル、j は特徴、y は微生物数、θ は非生物学的ゼロの指標、η は平均特徴数、x は共変量、β は推定される回帰係数 (対数)倍変化)、π は非生物学的ゼロの確率、z はケージ識別子変数、u はケージの変量効果、ϕ は過分散パラメーターです。株レベルの差異的存在量に関連する機能的変化を比較するために、比較ゲノミクス経路完全性アプローチが採用された。まず、特徴付けられた遺伝子を反応にマッピングし、最終的に経路にマッピングすることにより、MetaCyc63 経路の完全性 (0 から 1 の範囲の割合) を介して各ゲノムを評価しました。次いで、各経路を、スピアマンの順位相関によって、上記のモデルから決定されたベータ差分存在量と相関させた。セリン生合成、グリシン切断、および脂肪酸合成経路は、ベータと有意に相関していました。これらの相関関係を検証するために、完全な経路を有するゲノム（完全性 = 1）とそうでないゲノム（完全性 < 1）の存在量の合計の対数比を治療群間で評価しました。

小型感覚 C 線維機能は、前述のように熱侵害受容試験装置 (UARD) を使用して熱に対する行動反応によって定量化されました 64。簡単に説明すると、装置の表面は 30 °C まで温められ、動物は試験前に 20 ～ 30 分間個別の試験室に置かれました。 4 つの別々の応答潜時測定を実行し、最後の 3 回の平均値を各動物の応答潜時を表すために取得しました。すべての測定は、治療グループを知らない観察者によってコード化された動物に対して行われました。

動物をフォン・フライスタンドに置き、20 ～ 30 分間順応させました。使用した手動 von Frey フィラメントの範囲: 2.44、2.83、3.22、3.61、3.84、4.08、4.31、4.56、4.74 (Kom Kare)。テストは 3.84 フィラメントから始まり、加えられる圧力は 5 回繰り返されました。肯定的な応答が観察された場合、次に重み付けの低いフィラメントがシーケンスで使用されました。否定的な応答の場合、次に高い重み付けのフィラメントが適用されました。すべての測定は、治療グループを知らない観察者によってコード化された動物に対して行われました。

運動神経の伝導は、EZ Anesthesia Versaflex システム (Braintree Scientific、Z-7150) を使用して、麻酔をかけたマウスで定量化されました。簡単に言うと、軽く麻酔をかけたマウスを、フェイスマスクを介して麻酔を維持しながら水で加熱したパッド上に移した。 2 つの記録白金電極を動物の第 2、第 3、および第 4 指の間に挿入し、接地電極を首の皮膚に挿入しました。 PowerLab 刺激装置は、2 秒ごとに 200 mV、50 μs の方形波刺激を送信しました。刺激電極を足首のアキレス腱付近に挿入し、続いて股関節の坐骨切痕に挿入し、M 波を記録しました。記載されているように、アキレス腱と坐骨切痕の間の潜時を使用して神経伝導速度を計算しました64。すべての測定は、治療グループを知らない観察者によってコード化された動物に対して行われました。

角膜神経の定量化は、前述したように、Tomocap (Heidelberg Engineering、0220-001) を備えた Rostock Cornea Module (Heidelberg Engineering) を備えた網膜トモグラフ 3 を使用して、麻酔をかけたマウス (EZ Anesthesia Versaflex システム、Braintree Scientific、Z-7150 を使用) で実施されました 64。簡単に言うと、軽く麻酔をかけたマウスを小動物プラットフォームに移し、フェイスマスクで麻酔を維持した。均一な倍率とサイズの 40 枚の連続画像が収集され、基底神経叢の神経を含む画像が特定されました。 ImageJ ソフトウェア (ImageJ 1.53e Java 1.8.0_172) を使用して、各画像内の角膜神経領域を定量化し、データはピクセル/画像として表示されました。すべての測定は、治療グループを知らない観察者によってコード化された動物および画像に対して行われました。

表皮神経支配の定量化は、以前に詳細に記載されているように、汎ニューロンタンパク質 PGP9.5 の免疫染色によって足の皮膚サンプルで実行されました 64。簡単に言うと、足の皮膚サンプルを 4% 緩衝パラホルムアルデヒド (Thermo Scientific、J19943-K2) 中に収集しました。表皮神経の染色は、抗PGP9.5抗体(ProteinTech、14730-1-AP; 1:500希釈)を使用して実施した。倍率40倍の光学顕微鏡を使用して、表皮に存在するPGP9.5陽性プロファイルの数を計算し、皮膚切片の長さを計算し、IENFプロファイル密度をプロファイルmm-1として表した。すべての測定は、治療グループを知らない観察者によってコード化されたスライド上で行われました。

血漿極性代謝産物は、既知量の 13C および 15N 標識標準 (Cambridge Isotope Laboratories、MSK-A2-1.2) をスパイクした 3 μl の血漿から抽出しました。組織代謝産物の抽出は、以前に記載されているように実行されました21。簡単に説明すると、約 20 mg の組織を、-20 °C のメタノール 500 μl、氷冷生理食塩水 400 μl、氷冷水 100 μl を含む Precellys ビーズを使用して 2 分間ホモジナイズし、13C/15N 極性代謝物標準 (Cambridge Isotope) を添加しました。 Laboratories、MSK-A2-1.2)、20 pmol のスフィンガニン-d7 (Avanti Polar Lipids、860658)、2 pmol のデオキシスフィンガニン-d3 (Avanti Polar Lipids、860474)、100 pmol の 13C-ジヒドロセラミド-d7 (Avanti Polar Lipids、 330726)、200 pmolのC15-セラミド-d7 (Avanti Polar Lipids、860681)、10 pmolのd18:1-d7 グルコシルスフィンゴシン (Avanti Polar Lipids、860695)、100 pmolのd18:1-d7/15:0 グルコシルセラミド( Avanti Polar Lipids、330729)、100 pmolのd18:1-d7/15:0 ラクトシルセラミド (Avanti Polar Lipids、330727)、200 pmolのスフィンゴシン-d7 (Avanti Polar Lipids、860657)、および200 pmolのd18:1/ 18:1-d9 スフィンゴミエリン (Avanti Polar Lipids、791649)。 1-デオキシジヒドロセラミドの同定は、保持時間のマッチングと、m18:0/24:1 deoxyDHCer (Avanti Polar Lipids、860464) および m18:0/16:0 deoxyDHCer (Avanti Polar Lipids、860462) 標準の分析、および正規化によって確認されました。 1-デオキシジヒドロセラミドの分析は、13C-ジヒドロセラミド-d7 標準を使用して行われました。ホモジネートアリコート50μlを採取し、BCAタンパク質アッセイ(Lambda Biotech、G1002)を使用して組織タンパク質含量を測定した。残りのホモジネートを2 mlエッペンドルフチューブに移し、-20℃のクロロホルム1 mlを加えた。サンプルを 5 分間ボルテックス混合し、4 °C、15,000 g で 5 分間遠心分離しました。有機相を収集し、残りの極性相に2μlのギ酸を加え、1mlの-20℃のクロロホルムで再抽出した。合わせた有機相を乾燥させ、ペレットを、100%メタノール、1mMギ酸アンモニウムおよび0.2%ギ酸を含有する緩衝液100μlに再懸濁した。データは、クラス固有の内部標準および組織タンパク質含有量によって正規化されたイオン数を表し、アシル鎖の分布を表す積み上げプロットが示されています。

極性代謝産物の定量は、ピリジン中の 2% (w/v) メトキシアミン塩酸塩 (Thermo Scientific) (37 °C で 60 分間) および 1% tert-ブチルジメチルクロロシランを含む N-tert-ブチルジメチルシリル-N-メチルトリフルオロアセトアミド (MTBSTFA) で誘導体化した後に測定しました。 (tBDMS) (Regis Technologies) (37 °C で 30 分間)。極性誘導体は、前述のように、Agilent 5975 C 質量分析計と接続された Agilent 7890 A ガスクロマトグラフに取り付けられた DB-35MS カラム (30 m × 0.25 mm 内径 × 0.25 μm、Agilent J&W Scientific) を使用した GC-MS によって分析されました 65。血漿グルコース濃縮は、前述のように無水プロピオン酸誘導体化を使用して測定されました66。自然同位体存在量は社内スクリプトを使用して修正されました51。

スフィンゴ脂質代謝産物の定量は、トリプル四重極液体クロマトグラフィー - 質量分析プラットフォーム (Agilent 6460) を使用して決定されました。スフィンゴ脂質種は、前述のように C8 カラム (Spectra 3 μm C8SR 150 × 3 mm 内径、Peeke Scientific) で分離されました 67。移動相 A は 2 mM ギ酸アンモニウムと 0.2% ギ酸を含む 100% HPLC グレードの水で構成され、移動相 B は 0.2% ギ酸と 1 mM ギ酸アンモニウムを含む 100% メタノールで構成されました。流量は0.5ml/分であった。勾配溶出プログラムは次のプロファイルから構成されていました: 0 分、82% B; 3 分、82% B; 4 分、90% B、18 分、99% B; 25 分、99%、27 分、82% B、30 分、82% B。各サンプルの後にカラムの再平衡化を 10 分間続けました。毛細管電圧は 3.5 kV、乾燥ガス温度は 350 °C、乾燥ガス流量は 10 l min-1、ネブライザー圧力は 60 psi に設定されました。スフィンゴ脂質種は、関連する最適化された衝突エネルギーおよびフラグメンター電圧での前駆体イオンから生成物イオンへの遷移の選択反応モニタリング (SRM) によって分析されました (補足表 2)。スフィンゴ脂質種の定量は、スパイクイン重水素化標準を使用して実行されました。

Precellys Evolution ホモジナイザー (Bertin Technologies) を使用して、内部標準として既知濃度のノルバリンを含む、-20 °C の 5:3:2 アセトニトリル:メタノール:水溶液スパイク 800 µl で、約 10 ～ 20 mg の凍結組織を抽出しました68。。抽出後、BCA タンパク質アッセイ (Lambda Biotech、G1002) を使用したタンパク質定量のために 50 μl のアリコートを採取し、残りの抽出物を 21,000 g、4 °C で 10 分間遠心分離しました。次に、上清をガラスバイアルに移し、iHILIC-(P) Classic、150 mm x 2.1 mm、5- 上の Vanquish Flex Binary UHPLC システム (ThermoFisher Scientific) を備えた Q Exactive Orbitrap MS を使用して、クロマトグラフィーによる分離と化合物の同定を実行しました。 mm 粒子、200 Å (Hilicon) カラム、45 °C。クロマトグラフィーは、0.1% 水酸化アンモニウム (25%) 溶液 (移動相 A) および 100% アセトニトリル (移動相 B) で pH 9.4 に調整した 20 mM 炭酸アンモニウムの勾配を使用し、どちらも流速 0.2 ml/分で実行しました。 −1。液体クロマトグラフィーの勾配は、２分から１７分まで８０％から２０％Ｂまで直線的に進み、次に１７分から１８分まで２０％から８０％Ｂになり、その後１８分から２５分まで８０％Ｂに保った。

EquiSPLASH 標識標準 (Avanti Polar Lipids、330731) およびノルバリンを添加した Precellys Evolution ホモジナイザー (Bertin Technologies) を使用して、肝臓サンプルを -20 °C メタノール 400 μl で抽出しました。抽出後、BCA タンパク質アッセイ (Lambda Biotech、G1002) を使用してタンパク質含有量を定量するために 50 μl のアリコートを採取し、残りの抽出物に 400 μl の -20 °C クロロホルムと 400 μl の氷冷水を加えました。 5 分間ボルテックスした後、サンプルを 4 °C、15,000 g で 5 分間回転させ、有機相を収集しました。 2 マイクロリットルのギ酸を残りの極性相に添加し、400 μl の -20 °C クロロホルムで再抽出し、サンプルをボルテックス混合し、上記のように回転させました。合わせた有機相を乾燥させ、ペレットを100μlのイソプロパノールに再懸濁した。

クロマトグラフィーによる分離と脂質種の同定は、Accucore C30、150 × 2.1 mm、2.6 μm 粒子 (Thermo) カラムを備えた Vanquish Flex Binary UHPLC システム (Thermo Scientific) を備えた Q Exactive オービトラップ質量分析計を使用し、40 °C で実行されました。 5 マイクロリットルのサンプルを注入しました。クロマトグラフィーは、40:60 v/v 水: アセトニトリル (10 mM ギ酸アンモニウムおよび 0.1% ギ酸を含む) (移動相 A) および 10:90 v/v アセトニトリル: プロパン-2-オール (10 mM ギ酸アンモニウムを含む) の勾配を使用して実行しました。および 0.1% ギ酸 (移動相 B)、両方とも 0.2 ml min-1 の流速で。液体クロマトグラフィーの勾配は、3 ～ 8 分で 30% ～ 43% B、次に 8 ～ 9 分で 43% ～ 50% B、9 ～ 18 分で 50 ～ 90% B、次に 90 ～ 99% B となりました。 18 ～ 26 分間維持し、26 ～ 30 分間 99% B に保持した後、6 分で 30% B に戻し、さらに 4 分間保持します。

脂質は、スプレー電圧 3.2 kV を使用したポジティブモードで分析されました。スイープガス流量は 1 任意単位、補助ガス流量は 2 任意単位、シースガス流量は 40 任意単位で、キャピラリー温度は 325 °C でした。フル質量分析 (スキャン範囲 200 ～ 2,000 m/z) を 70,000 分解能、106 自動ゲイン制御、最大注入時間 100 ms で使用しました。最大注入時間 50 ms、105 に設定された自動ゲイン制御を備えた 17,500 分解能のデータ依存 MS2 (トップ 6) モードが使用されました。データはEI-Mavenソフトウェアを使用して分析され、ピークはAvanti EquiSPLASH内部標準に対して正規化されました。同定および定量化に使用される脂質種特異的フラグメントを補足表 3に示します。

血漿スフィンゴ脂質は、若干の変更を加えて以前に記載されたように処理されました69。簡単に説明すると、50 μl の血漿を 0.5 ml のメタノールと混合し、内部標準であるスフィンガニン d7、スフィンゴシン d7 およびデオキシスフィンガニン d3 (Avanti 脂質) を添加しました。サンプルを37℃で1時間ミキサーに置き、2,800gで遠心分離し、上清を収集し、75μlのメタノール性HCl（メタノール中1N HCl、10M H2O）を用いて65℃で一晩酸加水分解した。次に、10M KOH 100μlを加えて中和した。 625μlのクロロホルム、100μlの2N NH4OHおよび500μlのアルカリ水を加え、サンプルをボルテックス混合し、16,000gで5分間遠心分離した。下側の有機相をアルカリ水で３回洗浄し、風乾した。 LC-MS 分析は、Agilent 6460 QQQ LC-MS/MS で実行されました。代謝物の分離は、C18 カラム (Luna 100 × 2.1 mm、3 μm、Phenomenex) を使用して達成されました。移動相 A は 60:40 のメタノール:水の比率で構成され、移動相 B は 0.1% ギ酸を含む 100% メタノールで構成され、両方の移動相に 5 mM ギ酸アンモニウムが添加されました。勾配溶出プログラムは、40% B で 0.5 分間保持し、15 分間かけて 100% B まで直線的に増加させ、それを 9 分間維持し、その後 10 分間初期条件に再平衡化することから構成されました。毛細管電圧は 3.5 kV、乾燥ガス温度は 350 °C、乾燥ガス流量は 10 l min-1、ネブライザー圧力は 60 psi に設定されました。スフィンゴイド塩基は、関連する最適化された衝突エネルギーとフラグメンター電圧での前駆体イオンから生成物イオンへの遷移の SRM によって分析されました 16。次に、既知の濃度のスパイク内部標準からスフィンゴイド塩基を定量しました。

凍結肝臓および腎臓サンプルを、ガラスホモジナイザーを使用して、50 mM KH2PO4、1 mM Na2EDTA、および 1 mM DTT を含む氷冷バッファー (pH 8.0) で抽出しました。最大酵素活性は、200 mM セリン、0.25 mM NADH、0.17 mM ピリドキサールリン酸、および 1 mM DTT の存在下での乳酸デヒドロゲナーゼ (Sigma 10127230001) との共役酵素反応を 3 分間使用して測定しました。続いて、BCAタンパク質アッセイ(Lambda Biotech、G1002)を使用して組織ホモジネートタンパク質の定量を決定し、最大酵素活性をタンパク質1 mgあたりの国際単位(U)で表しました。

メーカーの指示に従って、Direct-Zol RNA キット (Direct-Zol RNA Miniprep Plus キット、Zymo Research) を使用して、約 20 mg の肝臓組織から RNA を抽出しました。 cDNA 合成は、製造元の指示に従って RT-PCR 用 iScript Reverse Transcription Supermix (iScript Reverse Transcription Supermix、Bio-Rad) を使用し、次のプロトコールに従って実行しました: 25 °C で 5 分間、46 °C で 20 分間、95 °C で 1 分間C. PCR 反応は、Applied Biosystems ViiA 7 リアルタイム PCR システムの 96 ウェルプレートを使用し、次のパラメーターを使用して実行されました: 95 °C 20 秒、95 °C 1 秒、および 60 °C 20 秒の 40 サイクル。 PCR SYBR-Green 反応の最終容量 (10 μl) は、5 μl の fast SYBR-Green Master Mix (Applied Biosystems)、2 μl の cDNA、1 μl の 5 μM フォワードおよびリバースプライマー、および 1 μl の水で構成されていました。

使用したプライマーは以下の通りである。 18 秒順方向: AGTCCCTGCCCTTTGTACACA、18 秒逆方向: CGATCCGAGGGCCTCACTA。 Acc1 順方向: AATGAACGTGCAATCCGATTTG、Acc1 逆方向: ACTCCACATTTGCGTAATTGTTG; Acc2 フォワード: CGCTCACCAACAGTAAGGTGG、Acc2 リバース: GCTTGGCAGGGAGTTCCTC; Acly フォワード: AATCCTGGCTAAAACCTCGCC、Aly リバース: GCATAGATGCACACGTAGAACT; アクチンフォワード: GGCTGTATTCCCTCCATCG、アクチンリバース: CCAGTTGGTAACAATGCCATGT; Aldh1l1 順方向: AGCCACCTATGAGGGCATTC、Aldh1l1 逆方向: TGAGTGTCGAGTTGAAAAACGTC; Aldh1l2 順方向: ACCAGCCGGGTTTATTTCAAA、Aldh1l2 逆方向: ACTCCCACTACTCGGTGGC; Dgat1 順方向: CTGATCCTGAGTAATGCAAGGTT、Dgat1 逆方向: TGGATGCAATAATCACGCATGG; Dgat2 順方向: GCGCTACTTCCGAGACTACTT、Dgat2 逆方向: GGGCCTTATGCCAGGAAACT; Dhcr7 フォワード: AGGCTGGATCTCAAGGACAAT、Dhcr7 リバース: GCCAGACTAGCATGGCCTG; Dhcr24 順方向: CTCTGGGTGCGAGTGAAGG、Dhcr24 逆方向: TTCCCGGACCTGTTTCTGGAT; DLD 順方向: AGCTGGAGTCGTGTGTACC、DLD 逆方向: GAACCTATCACTGTCACGTCA; 順方向: GGAGGTGGTGATAGCCGGTAT、逆方向: TGGGTAATCCATAGAGCCCAG; Fdft1 順方向: GTTTGAAGACCCATAGTTGGTG、Fdft1 逆方向: CACATCTACGTTCTCTGGCTTAG; Fdps フォワード: GGAGGTCCTAGAGTACAATGCC、Fdps リバース: AAGCCTGGAGCAGTTCTACAC; Ggps1 順方向: TTCACAGGCATTTAATCACTGGC、Ggps1 逆方向: ACCACGTCGGAGCTTTGAAC; Gldc フォワード: CTCCTGCCCAGACACGAT、Gldc リバース: GGGACCGTCTTCTCGATGAG; Gpat1 順方向: CTTGGCCGATGTAAACACACC、Gpat1 逆方向: CTTCCGGCTCATAAGGCTCTC; GPAT4 フォワード: TCAAAGAAATTCGTCGAAGTGGT、Gpat4 リバース: CCTTTCCGGCAAAAGTAGAAGAT; Hmgcs1 順方向: AACTGGTGCAGAAATCTCTAGC、Hmgcs1 逆方向: GGTTGAATAGCTCAGAACTAGCC; Hmgcr 順方向: AGCTTGCCCGAATTGTATGTG、Hmgcr 逆方向: TCTGTTGTGAACCATGTGACTTC; Lss 順方向: TCGTGGGGGACCCTATAAAAC、Lss 逆方向: CGTCCTCCGCTTGATAATAAGTC; Mthfd1 順方向: CTCCTGTCCCAAGTGACATTG、Mthfd1 逆方向: TAGCCTTCGTTTCCCCGTACA; Mthfd2 順方向: AGTGCGAAATGAAGCCGTTG、Mthfd2 逆方向: GACTGGCGGGATTGTCACC; Mthfd1l 順方向: GCATGGCCTTACCCTTCAGAT、Mthfd1l 逆方向: GTACGAGCTTCCCCAGATTGA; Mthfd2l 順方向: AAGGACGTTGATGGATTTCACAT、Mthfd2l 逆方向: GATGATTTCCCAAACGGCACT; 順方向の転送: AGATGAGGCGCAGAATGGAC、逆方向の転送: CATCCGGTCAAACCTGGAGAT; 順方向MTR: TCCTCCTCGGCCTATCTTTATTT、逆方向MTR: GGTCCGAATGAGACACGCT; Mvk 順方向: GGTGTGGTCGGAACTTCCC、Mvk 逆方向: CCTTGAGCGGGTTGGAGAC; Mvd 順方向: ATGGCCTCAGAAAAGCCTCAG、Mvd 逆方向: TGGTCGTTTTTAGCTGGTCCT; Pmvk 順方向: CCTATGGGGCTGTGATACAGA、Pmvk 逆方向: TCTCCGTGGTTCTCAATGACC; Psat 順方向: CAGTGGAGCGCCAGAATAGAA、Psat 逆方向: CCTGTGCCCCTTCAAGGA; Psph 順方向: TGAGTACGCAGGTTTTGATGAG、Psph 逆方向: TGAGTACGCAGGTTTTGATGAG; Phgdh フォワード: ATGGCCTTCGCAAATCTGC、Phgdh リバース: AGTTCAGCTATCAGCTCCTCC; Scd1 順方向: TTCTTGCGATACACTCTGGTGC、Scd2 逆方向: CGGGATTGAATGTTCTTGTCGT; Scd2 順方向: GATCTCTGGCGCTTACTCAGC、Scd2 逆方向: CTCCCCAGTGGTGAGAACTC; データ転送: GAAGACCCCACTTCGTGACAG、データ転送: TCTTGCAGAGATGCCCAATGC; Shmt1 順方向: CAGGGCTCTGCTTGATGCAC、Shmt1 逆方向: CGTAACGCGCTCTTGTCAC; Shmt2 順方向: TGGCAAGAGATACTACGGAGG、Shmt2 逆方向: AGATCGCCTTTGACATCAGACA; 順方向SQL: ATAAGAAAATGCGGGGATGTCAC、逆方向SQL: ATATCCGAGAAGGCAGCGAAC; Srebp1a 順方向: TAGTCCGAAGCCGGGTGGGCGCCGG、Srebp1a 逆方向: GATGTCGTTCAAAACCGCTGTGTGTC; Srebp1c 順方向: AAGCAAATCACTGAAGGACCTGG、Srebp1c 逆方向: AAAACAAGCTACTCTGGGAG; Srebp2 順方向: GGATCCTCCCAAAGAAGGAG、Srebp2 逆方向: TTCCTCAGAACGCCAGACTT; 順方向: GGAAGGGTGTTTTGGAGGAGT、逆方向: GCTGTCCAGAAAATCTCGGGA。

組織タンパク質レベルを比較するために、約 20 mg の組織を 5 mM EDTA 溶液 (Thermo Scientific)、プロテアーゼ阻害剤カクテル (cOmplete、Roche)、およびホスファターゼ阻害剤カクテル (PhosSTOP、Roche) を添加した RIPA バッファー中でホモジナイズし、氷上に静置しました。 30分。組織溶解物を 4 °C、13,000 g で 10 分間遠心分離し、上清を -80 °C で保存しました。ホモジネートのタンパク質含有量は、ビシンコニン酸アッセイ (Thermo Scientific) を使用して測定しました。タンパク質サンプルを Laemmli バッファー (NuPAGE LDS サンプルバッファー、Life Technologies) で調製し、4 ～ 15% プレキャストゲル (Mini-PROTEAN TGX、Bio-Rad) 上で 2 時間一定の 100 V で泳動し、ポリフッ化ビニリデン上に転写しました。 (PVDF) 膜を氷冷したトランスファータンク内で 250 mA の定電流で 2 時間処理します。メンブレンを 5% ミルクでブロックし、ACLY (Cell Signaling 13390、1:1,000)、ACC (Cell Signaling 3662、1:2,000)、p-AKT Ser473 (Cell Signaling 9271) に対する一次抗体とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。、1:1,000)、p-AKT Ser308 (セルシグナリング 9275、1:1,000)、AKT (セルシグナリング 75692、1:1,000)、SCD1 (セルシグナリング 2794、1:1,000)、GAPDH (セルシグナリング 5174、1: 4,000)、ビンキュリン (Cell Signaling 4650、1:1,000)。 TBS-T で洗浄した後、メンブレンを西洋わさびペルオキシダーゼ結合二次抗体 (Cell Signaling 7074、1:5,000) とともに室温で 1 時間インキュベートし、増強された化学発光液体 (Clarity Western ECL Substrate、Bio-Rad) とともに 1 時間インキュベートしました。 5分。濃度測定による定量化は、Image Lab ソフトウェア (Bio-Rad) を使用して実行されました。分子量マーカーを使用した生のスキャンについては、補足図 1 を参照してください。

特に明記しない限り、データは平均値±標準誤差として表されます。統計分析は、Prism ソフトウェア (GraphPad Prism 9.3.1) を使用して実行されました。両側独立 t 検定を使用して 2 つのグループを比較し、一元配置分散分析とフィッシャーの最小有意差事後検定を使用して 3 つ以上のグループを比較し、二元配置分散分析を使用しました。フィッシャーの最小有意差事後検定を使用して 2 因子研究デザインを比較し、PERMANOVA 分析を使用して RPCA プロットを調査します。すべてのテストについて、P < 0.05 が有意であるとみなされました。原稿内のすべてのデータポイントは、個々の生物学的複製を表します。サンプルサイズを事前に決定するために統計的手法は使用されませんでした。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

マイクロバイオームアルゴリズムとイムノブロットのソースデータは補足情報として提供されます。全マイクロバイオームゲノムシーケンスの生データを Qiita53 にアップロードし、デフォルトの処理ワークフローに従いました。高分解能でターゲットを絞った質量分析データは、NIH 共通基金の国立メタボロミクスデータリポジトリ (NMDR) の Web サイト、メタボロミクスワークベンチ (https://www.metabolomicsworkbench.org) で入手できます。プロジェクト ID M8JD81 (https:/) が割り当てられています。 /doi.org/10.21228/M8JD81)。データには、プロジェクト ID M8JD81 を介して直接アクセスできます。調査結果を裏付ける追加データは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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有益な議論をしていただいた Metallo 研究室のメンバー全員に感謝するとともに、M. Friedlander、E. Holmes、A. Tayerani の意見に感謝します。この研究は、NIH (CMM への R01CA234245、MKH への NIDDK MICROMouse Funding DK076169、および AC への R01AG065993)、カミーユおよびヘンリードレイファス教師奨学生賞 (CMM へ)、ローウィー医学研究所 (CMM へ)、およびアメリカ心臓協会 (AC への 18CDA34110292)。この研究は、NIDDK が資金提供するサンディエゴ消化器疾患研究センターの助成金 (P30 DK120515) によっても支援されました。

分子細胞生物学研究所、ソーク生物学研究所、ラホーヤ、カリフォルニア州、米国

ミハル・K・ハンズリク、ジバニ・M・ゲンガタラン、グレース・H・マクレガー、コートニー・R・グリーン、パトリック・ツェン、クリスチャン・M・メタロ

カリフォルニア大学サンディエゴ校生物工学部、ラホーヤ、カリフォルニア州、米国

ミハル・K・ハンズリク、ジバニ・M・ゲンガタラン、グレース・H・マクレガー、アナ・M・モレノ、コートニー・R・グリーン、プラシャント・マリ、ロブ・ナイト、クリスチャン・M・メタロ

カリフォルニア大学サンディエゴ校医学部病理学教室、ラホーヤ、カリフォルニア州、米国

ケイティ・E・フリッツィ、ルーシー・S・ガーンジー、ナイジェル・A・カルカット

カリフォルニア大学サンディエゴ校医学部小児科、ラホーヤ、カリフォルニア州、米国

キャメロン・マルティーノ、ジブラン・ラーマン、アントニオ・ゴンザレス、ロブ・ナイト

バイオインフォマティクスおよびシステム生物学プログラム、カリフォルニア大学サンディエゴ校、ラホーヤ、カリフォルニア州、米国

キャメロン・マルティーノ、ジブラン・ラーマン、ロブ・ナイト

カリフォルニア大学サンディエゴ校、マイクロバイオームイノベーションセンター、米国カリフォルニア州ラホーヤ

キャメロン・マルティーノ & ロブ・ナイト

米国カリフォルニア州ラホーヤ、ソーク生物学研究所、レギュラトリーバイオロジー研究所

テリー・リン＆サッチダナンダ・パンダ

スクリップス研究所、ラホーヤ、カリフォルニア州、米国

Yoichiro Ideguchi

ローウィ医学研究所、ラホーヤ、カリフォルニア州、米国

レジス・J・ファロン＆マリン・L・ガントナー

ユタ大学、ユタ州ソルトレイクシティ、栄養および統合生理学学部

アマンディーヌ・シェイクス

ユニバーシティ・カレッジ・ダブリン、農業・食品科学部、ダブリン、アイルランド

マルチナ・ウォレス

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MKH と CMM が研究を設計しました。 MKH、JMG、AMM、YI、KEF、LSG、PT、および RJF は、行動アッセイ、GTT、および ITT を実行しました。 MKH、GHM、および CRG は、安定同位体トレーサーとターゲットを絞ったメタボロミクスおよびリピドミクスデータを生成および分析しました。 CM、GR、および AG は、系統発生的なアルファおよびベータ多様性および経路分析を含むマイクロバイオーム分析を実施しました。 TLとACは糞便爆弾熱量測定実験を実施した。 SP、MW、PM、RK、MLG、NAC、CMM に基づく実験計画と分析。 MKH と CMM は、すべての著者からの意見をもとに原稿を執筆しました。

クリスチャン・M・メタロへの通信。

CMM は Faeth Therapeutics の科学顧問です。他の著者は競合する利益を宣言していません。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

(a) WT マウスおよび BKS-db/db マウスの腎臓におけるグリシン、セリン、およびメチオニンのレベル (グループあたり n = 6)。 (b) WT マウスおよび BKS-db/db マウスの鼠径部脂肪組織 (iWAT) におけるグリシン、セリン、およびメチオニンのレベル (グループあたり n = 6)。 (c) WT および BKS-db/db マウスの血漿代謝物レベル (グループあたり n = 6)。（ d ）WT（n = 6）およびBKS-db / dbマウス（n = 5）におけるセリン、グリシン、および一炭素代謝を調節する腎臓酵素のmRNA発現。（ e ）一晩絶食後のC57BL / 6Jマウスにおけるセリン耐性試験（STT）（用量あたりn = 4）。（ f ）一晩絶食した後、経口強制経口投与による[U-13C3]セリン投与15分後のWTマウスにおける組織セリン標識画分（組織あたりn = 4）。（ g ）一晩絶食した後、経口強制経口投与による[U-13C3]セリン投与15分後のWTマウスにおける組織クエン酸標識画分（組織あたりn = 4）。データは平均±平均の標準誤差（SEM）であり、両側独立t検定（a〜d）を使用して分析されました。 * P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001、**** P < 0.0001 対 WT グループ。

(a) 給餌状態の C57BL/6J マウスの肝臓および腎臓で測定されたセリンデヒドラターゼ活性 (組織あたり n = 5)。 (b) 6 時間の絶食後に定量化された WT および BKS-db/db マウスの血清インスリン (グループあたり n = 6)。（ c ）6時間の絶食後に定量化されたWT（n = 5）およびBKS-db / db（n = 6）マウスの血清グルカゴン。（ d ）一晩絶食した後、2 g / kgでグルコースを投与したGTT / STT後のWTおよびBKS-db / dbマウスの血漿グルコース薬物動態および曲線下面積（AUCGLC）（グループあたり n = 6）。（ e ）一晩絶食した後、2 g / kgでグルコースを投与したGTT / STT後のWTおよびBKS-db / dbマウスの血漿グリシン薬物動態および曲線下面積（AUCGLY）。（ f ）一晩絶食した後のみセリン（400 mg / kg）を投与されたWTおよびBKS-db / dbマウス（グループあたりn = 6）におけるセリン耐性試験（STT）および曲線下面積（AUCSER）。（ g ）注射後1週間のビヒクルまたはストレプトゾトシン（STZ）で処置したC57BL / 6Jマウスの絶食（6時間）血漿インスリンレベル（グループあたりn = 9）。（ h ）注射後1週間のビヒクルまたはストレプトゾトシン（STZ）で処置したC57BL / 6Jマウスの空腹時（6時間）血糖値（グループあたりn = 9）。 (i) 注射後 1 週間のビヒクルまたはストレプトゾトシン (STZ) で処置した C57BL/6J マウスの体脂肪量 (各グループ n = 9)。（ j ）注射後1週間のビヒクル（n = 9）またはストレプトゾトシン（STZ、n = 10）で処理されたC57BL / 6Jマウスの空腹時（6時間）血漿アミノ酸濃度。（ k ）グルコース投与の注射後2週間、ビヒクル（n = 7）またはストレプトゾトシン（STZ、n = 6）で処置したC57BL / 6JマウスのGTT / STT中の一晩絶食後の血漿グルコース薬物動態および曲線下面積（AUCGLC）。 2g/kgで。 (l) 14週齢のWTおよびBKS-db/dbマウスにおける熱潜伏期間(グループあたりn = 6)。 (m) 14 週齢の WT および BKS-db/db マウスにおける触覚センシング (グループあたり n = 6)。 (n) 14週齢のWTおよびBKS-db/dbマウスにおける運動神経伝導速度(各グループn = 6)。データは平均値±平均値の標準誤差（SEM）であり、両側独立t検定（b-n）およびフィッシャーLSD事後検定による二元配置分散分析（e-f、k時間経過実験）を使用して分析されました。）。

(a) 低脂肪食 (LFD、n = 5)、セリン/グリシンを含まない LFD (-SG LFD、n = 8)、高脂肪食 (HFD、 n = 8)、およびセリン/グリシンを含まない HFD (-SG HFD、n = 8) を 18 週間投与しました。（b）低脂肪食（LFD、n = 10）、セリン/グリシンを含まないLFD（-SG LFD、n = 10）、高脂肪食（HFD、n = 10）を与えられたマウスの肝臓代謝物含有量、セリン/グリシンを含まない HFD (-SG HFD、n = 10) を 18 週間投与しました。 (c) 食事療法介入後 18 週間の体重増加 (各グループ n = 13)。（d）低脂肪食（LFD、n = 10）、セリン/グリシンを含まないLFD（-SG LFD、n = 12）、高脂肪食（HFD）を与えたマウスにおける18週間の食餌摂取に応じた食物摂取量、n = 13)、およびセリン/グリシンを含まない HFD (-SG HFD、n = = 13)。（e）低脂肪食（LFD、n = 10）、セリン/グリシンを含まないLFD（-SG LFD、n = 12）、高脂肪食（HFD）を与えたマウスにおける18週間の食餌摂取に応じたカロリー摂取量、n = 13)、およびセリン/グリシンを含まない HFD (-SG HFD、n = 13)。（f）低脂肪食（LFD、n = 10）、セリン/グリシンを含まないLFD（-SG LFD、n = 12）、高脂肪食（HFD）を与えたマウスにおける18週間の食餌摂取に応じたカロリー吸収、n = 13)、およびセリン/グリシンを含まない HFD (-SG HFD、n = 13)。（g）低脂肪食（LFD、n = 10）、セリン/グリシンを含まないLFD（-SG LFD、n = 12）、高脂肪食（HFD）を与えたマウスにおける18週間の食餌摂取に応じた水分摂取量、n = 13)、およびセリン/グリシンを含まない HFD (-SG HFD、n = 13)。（h）低脂肪食（LFD、n = 10）、セリン/グリシンを含まないLFD（-SG LFD、n = 12）、高脂肪食（HFD）を与えたマウスにおける18週間の食餌摂取に応じた身体活動、n = 13)、およびセリン/グリシンを含まない HFD (-SG HFD、n = 13)。 (i) 低脂肪食 (LFD、n = 10)、セリン/グリシンを含まない LFD (-SG LFD、n = = 12) を与えたマウスにおける 18 週間の食餌摂取に応じた脂肪細胞サイズの代表的な画像と定量化、高脂肪食 (HFD、n = 13)、およびセリン/グリシンを含まない HFD (-SG HFD、n = 13)。（j）セリンおよびグリシンが豊富または欠乏している低脂肪食（LFD）または高脂肪食（HFD）を給餌してから18週間後のIP耐糖能試験（各グループn = 13）。 (k) セリンおよびグリシンが豊富または欠乏している低脂肪食 (LFD) または高脂肪食 (HFD) を給餌してから 18 週間後の IP インスリン負荷試験 (各グループ n = 15)。（l）マウスに低脂肪食（LFD、n = 10）、セリン/グリシンを含まないLFD（-SG LFD、n = 12）、高脂肪食（HFD、n = 12）を与えてから18週間後の呼吸交換比の時間経過13)、およびセリン/グリシンを含まない HFD (-SG HFD、n = = 13)。データは平均±平均の標準誤差（SEM）であり、フィッシャーLSD事後検定を備えた二元配置分散分析を使用して分析されました（a〜k）。 * P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001、**** P < 0.0001 対 LFD。 # P < 0.05 対 HFD グループ。

(a) マウスに低脂肪食 (LFD、n = 10)、セリン/グリシンを含まない LFD (-SG LFD、n = 10)、高脂肪食を与えてから 18 週間後のマイクロバイオームのベータ多様性の堅牢な主成分分析(HFD、n = 9)、およびセリン/グリシンを含まない HFD (-SG HFD、n = 9)。（b）マウスに低脂肪食（LFD、n = 10）、セリン/グリシンを含まないLFD（-SG LFD、n = 10)、高脂肪食 (HFD、n = 9)、およびセリン/グリシンを含まない HFD (-SG HFD、n = 9)。（c）マウスに低脂肪食（LFD、n = 10）、セリン/グリシンを含まないLFD（-SG LFD、n = 10）を与えてから18週間後のグリシン切断の完全な経路と不完全な経路を持つ種の対数比、高脂肪食 (HFD、n = 9)、およびセリン/グリシンを含まない HFD (-SG HFD、n = 9)。（ d ）マウスに低脂肪食（LFD、n = 10）、セリン/グリシンを含まないLFD（-SG LFD、n = 10）、高脂肪食（HFD、 n = 9)、セリン/グリシンを含まない HFD (-SG HFD、n = 9)。データは最小値/最大値 (b ～ c) として表示され、PERMANOVA 検定 (a) およびフィッシャー LSD 事後検定を使用した二元配置分散分析 (b ～ c) を使用して分析されました。

(a) 低脂肪食 (LFD、n = 3)、セリン/グリシンを含まない LFD (-SG LFD、n = 4)、高脂肪食 (HFD、n = 4) を与えられたマウスにおける血漿重水 (D2O) 濃縮5)、およびセリン/グリシンを含まない HFD (-SG HFD、n = 5)。（ b ）LFD（n = 3）、-SG LFD（n = 4）、HFD（n = 5）、および-SG HFD（n = 5）を18週間与えられたマウスにおけるde novoコレステロール合成。（ c ）ATPクエン酸リアーゼ（ACLY）、アセチルCoAカルボキシラーゼ（ACC）、ステロイルCoAデサチュラーゼ1（SCD1）、P-AktS473、およびP-AktT308の肝臓タンパク質発現（グループあたり n = 3）。（ d ）低脂肪食（LFD、n = 8）を与えられたマウスにおけるATPクエン酸リアーゼ（Acly）、アセチルCoAカルボキシラーゼ（Acc2）、およびステロイルCoAデサチュラーゼ1（Scd1）の肝臓mRNA発現、セリン/グリシンを含まない LFD (-SG LFD、n = 11)、高脂肪食 (HFD、n = 13)、およびセリン/グリシンを含まない HFD (-SG HFD、n = 10)。（ e ）低脂肪食（LFD、n = 8）、セリン/グリシンを含まないLFD（-SG LFD、n = 11）、高脂肪食を与えられたマウスにおける脂肪酸およびコレステロールの合成に関与する酵素の肝臓mRNA発現(HFD、n = 13)、およびセリン/グリシンを含まない HFD (-SG HFD、n = 10)。データは平均±平均の標準誤差（SEM）であり、フィッシャーLSD事後検定を備えた二元配置分散分析を使用して分析されました（a〜e）。 * P < 0.05、** P < 0.01、*** P < 0.001、**** P < 0.0001 対 LFD。 # P < 0.05 対 HFD グループ。

（ a ）12か月間、対照食（n = 10）またはセリン/グリシンを含まない方法（-Ser/Gly、n = 10）のいずれかを与えられたC57BL / 6Jマウスの熱潜伏の定量化。（ b ）12か月間対照（n = 2）またはセリン/グリシンを含まない食餌（n = 3）のいずれかを与えられたマウスの足の皮膚における表皮内神経線維（IENF）密度とIENFの定量化の代表的な画像。 IENFのPGP9.5染色を矢印で示す。 (c) 低脂肪食 + ビヒクル (LFD+Veh、n = 10)、LFD + 0.3 mg/kg ミリオシン (LFD+Myr、n = 10)、セリン/グリシンを含まない LFD を与えられたマウスの体重の時間経過+ 媒体 (-SG LFD+Veh、n = 10)、-SG LFD + ミリオシン (-SG LFD+Myr、n = 9)、高脂肪食 + 媒体 (HFD+Veh、n = 10)、HFD + ミリオシン ( HFD+Myr、n = 10)、セリン/グリシンを含まない HFD + ビヒクル (-SG HFD+Veh、n = 10)、および -SG HFD + ミリオシン (-SG HFD+Myr、n = 9)。（ d ）低脂肪食 + ビヒクル（LFD + Veh、n = 10）、LFD + 0.3 mg / kg ミリオシン（LFD + Myr、n = 10）、セリン/を与えられたマウスの食事介入後6か月後の体重増加。グリシンフリー LFD + ビヒクル (-SG LFD+Veh、n = 10)、-SG LFD + ミリオシン (-SG LFD+Myr、n = 9)、高脂肪食 + ビヒクル (HFD+Veh、n = 10)、 HFD + ミリオシン (HFD+Myr、n = 10)、セリン/グリシンを含まない HFD + ビヒクル (-SG HFD+Veh、n = 10)、および -SG HFD + ミリオシン (-SG HFD+Myr、n = 9) 。（ e ）低脂肪食 + ビヒクル（LFD + Veh、n = 9）、LFD + 0.3 mg / kg ミリオシン（LFD + Myr、n = 10）、セリン/グリシンフリー LFD + ビヒクル (-SG LFD+Veh、n = 10)、-SG LFD + ミリオシン (-SG LFD+Myr、n = 9)、高脂肪食 + ビヒクル (HFD+Veh、n = 10)、 HFD + ミリオシン (HFD+Myr、n = 10)、セリン/グリシンを含まない HFD + ビヒクル (-SG HFD+Veh、n = 10)、および -SG HFD + ミリオシン (-SG HFD+Myr、n = 9) 。 (f) 低脂肪食 + ビヒクル (LFD+Veh、n = 10)、LFD + 0.3 mg/kg ミリオシン (LFD+Myr、n = 10)、セリンを与えられたマウスの食事介入後 6 か月後の血漿アミノ酸濃度/グリシンフリー LFD + ビヒクル (-SG LFD+Veh、n = 10)、-SG LFD + ミリオシン (-SG LFD+Myr、n = 9)、高脂肪食 + ビヒクル (HFD+Veh、n = 10) 、HFD + ミリオシン (HFD+Myr、n = 10)、セリン/グリシンを含まない HFD + ビヒクル (-SG HFD+Veh、n = 10)、および -SG HFD + ミリオシン (-SG HFD+Myr、n = 9) ）。（g）低脂肪食 + ビヒクル（LFD+Veh、n = 10）、LFD + 0.3 mg/kg ミリオシン（LFD+Myr、n = 10）、セリン/グリシンフリーを与えられたマウスにおける肝臓セラミドのスタックプロットLFD + ビヒクル (-SG LFD+Veh、n = 10)、-SG LFD + ミリオシン (-SG LFD+Myr、n = 9)、高脂肪食 + ビヒクル (HFD+Veh、n = 10)、HFD + ミリオシン(HFD+Myr、n = 10)、セリン/グリシンを含まない HFD + ビヒクル (-SG HFD+Veh、n = 10)、および -SG HFD + ミリオシン (-SG HFD+Myr、n = 9)。 (h) 低脂肪食 + ビヒクル (LFD+Veh、n = 10)、LFD + 0.3 mg/kg ミリオシン (LFD+Myr、n = 10)、セリン/グリシンを与えられたマウスにおける坐骨神経セラミドのスタックプロットフリー LFD + ビヒクル (-SG LFD+Veh、n = 10)、-SG LFD + ミリオシン (-SG LFD+Myr、n = 9)、高脂肪食 + ビヒクル (HFD+Veh、n = 10)、HFD +ミリオシン (HFD+Myr、n = 10)、セリン/グリシンを含まない HFD + ビヒクル (-SG HFD+Veh、n = 10)、および -SG HFD + ミリオシン (-SG HFD+Myr、n = 9)。 (i) 低脂肪食 + ビヒクル (LFD+Veh、n = 10)、LFD + 0.3 mg/kg ミリオシン (LFD+Myr、n = 10)、セリンを与えられたマウスにおける坐骨神経デオキシジヒドロセラミド (デオキシDHCer) のスタックプロット/グリシンフリー LFD + ビヒクル (-SG LFD+Veh、n = 10)、-SG LFD + ミリオシン (-SG LFD+Myr、n = 9)、高脂肪食 + ビヒクル (HFD+Veh、n = 10) 、HFD + ミリオシン (HFD+Myr、n = 10)、セリン/グリシンを含まない HFD + ビヒクル (-SG HFD+Veh、n = 10)、および -SG HFD + ミリオシン (-SG HFD+Myr、n = 9) ）。データは平均±平均の標準誤差（SEM）であり、フィッシャーLSD事後テストを使用した二元配置分散分析（aおよびc）およびフィッシャーLSD事後テストを使用した一元配置分散分析（d-i）を使用して分析されました。 gi の統計分析は、スフィンゴ脂質の存在量の合計を使用して実行されました。

(a) 低脂肪食 + ビヒクル (LFD+Veh、n = 10)、高脂肪食 + ビヒクル (HFD+Veh、n = 7)、セリン/を与えられたマウスにおける表皮内神経線維 (IENF) 密度の代表的な画像。グリシンフリー HFD + ビヒクル (-SG HFD+Veh、n = 12)、および -SG HFD + ミリオシン (-SG HFD+Myr、n = 8)。 (b) 低脂肪食 + ビヒクル (LFD+Veh、n = 12)、高脂肪食 + ビヒクル (HFD+Veh、n = 12)、セリン/グリシンフリーを与えられたマウスの角膜神経の代表的な画像と定量化。 HFD + ビヒクル (-SG HFD+Veh、n = 12)、および -SG HFD + ミリオシン (-SG HFD+Myr、n = 11)。 (c) 低脂肪食 + ビヒクル (LFD+Veh、n = 12)、高脂肪食 + ビヒクル (HFD+Veh、n = 12)、セリン/グリシンを含まない HFD + ビヒクル (- SG HFD+Veh、n = 12)、および -SG HFD + ミリオシン (-SG HFD+Myr、n = 11)。 (d) 低脂肪食 + ビヒクル (LFD+Veh、n = 12)、高脂肪食 + ビヒクル (HFD+Veh、n = 12)、セリン/グリシンを含まない HFD + ビヒクルを与えられたマウスにおける運動神経伝導速度(-SG HFD+Veh、n = 12)、および -SG HFD + ミリオシン (-SG HFD+Myr、n = 11)。（e）低脂肪食+ビヒクル（LFD+Veh、n = 12）、高脂肪食+ビヒクル（HFD+Veh、n = 12）、セリン/を給餌されたマウスの給餌状態での肝臓高分解能リピドミクス分析。グリシンフリー HFD + ビヒクル (-SG HFD+Veh、n = 12)、および -SG HFD + ミリオシン (-SG HFD+Myr、n = 11)。データは平均±平均の標準誤差（SEM）であり、フィッシャーLSD事後検定を備えた一元配置分散分析を使用して分析されました（b〜e）。

a）16週齢のWTおよびBKS-db/dbマウスにおける加水分解血漿デオキシスフィンガニン（デオキシSA）濃度（グループあたりn = 6）。 b) 肝臓を標的としたスフィンゴ脂質の測定 16 週齢の WT および BKS-db/db マウス (1 グループあたり n = 6)。 c）ビヒクル（n = 10）またはミリオシン（0.3 mg/kg、隔日、n = 9）のいずれかで8週間処理したBKS-db/dbマウスの熱潜伏時間経過。 d）ビヒクル（n = 10）またはミリオシン（n = 9）のいずれかで8週間処理されたBKS-db/dbマウスの触覚感知。 e）ビヒクル（n = 10）またはミリオシン（n = 9）で8週間治療したBKS-db / dbマウスの表皮内神経線維密度。 f）ビヒクル（n = 10）またはミリオシン（n = 9）のいずれかで8週間処置したBKS-db/dbマウスの体重の経時変化。 g）ビヒクル（n = 10）またはミリオシン（n = 9）のいずれかで8週間処置したBKS-db/dbマウスの絶食（6時間）血糖時間経過。 h）ビヒクル（n = 10）またはミリオシン（n = 8）のいずれかで8週間処置したBKS-db/dbマウスの絶食（6時間）血漿セリン経時変化。 i) ビヒクル (n = 10) またはミリオシン (n = 9) で 8 週間治療した BKS-db/db マウスの肝臓スフィンゴ脂質の合計。 j) ビヒクル (n = 10) またはミリオシン (n = 9) で 8 週間治療した BKS-db/db マウスの足皮膚スフィンゴ脂質の合計。 k）ビヒクル（n = 10）またはミリオシン（n = 9）で8週間処理したBKS-db / dbマウスの肝臓デオキシジヒドロセラミド（デオキシDHCer）種のスタックプロット。 l）ビヒクル（n = 10）またはミリオシン（n = 9）のいずれかで8週間処理したBKS-db / dbマウスの足皮膚デオキシジヒドロセラミド（デオキシDHCer）種のスタックプロット。 m）ビヒクル（n = 10）またはミリオシン（n = 9）で8週間処理したBKS-db / dbマウスの肝臓スフィンゴミエリン（SM）種のスタックプロット。 n）ビヒクル（n = 10）またはミリオシン（n = 9）で8週間処理したBKS-db / dbマウスの足皮膚スフィンゴミエリン（SM）種のスタックプロット。データは平均値 ± 平均値の標準誤差 (SEM) であり、両側独立 t 検定 (a – b、d – e、i – n) およびフィッシャー LSD 事後検定 (c) を使用した二元配置分散分析を使用して分析されました。、f–h)。 kn における統計分析は、スフィンゴ脂質存在量の合計を使用して実行されました。

a）対照（n = 8）またはセリン添加食（n = 9）のいずれかを8週間給餌されたBKS-db/dbマウスの体重の経時変化。 b) コントロール (n = 8) またはセリン添加食 (n = 9) を 8 週間与えた BKS-db/db における絶食 (6 時間) 血糖の時間経過。 c) 対照食またはセリン添加食のいずれかを8週間与えたBKS-db/dbマウスの肝臓スフィンゴ脂質の合計(各群n = 8)。 d) 対照食またはセリン添加食のいずれかを8週間給餌したBKS-db/dbマウスの足皮膚スフィンゴ脂質の合計(各群n = 8)。 e）対照食またはセリン添加食のいずれかを8週間与えられたBKS-db/dbマウスの肝臓におけるスフィンゴミエリン種（SM）のレベル（各群n = 8）。 f) 対照食またはセリン添加食のいずれかを8週間与えたBKS-db/dbマウスの足皮膚におけるスフィンゴミエリン種(SM)のレベル(各群n = 8)。データは平均±平均の標準誤差（SEM）であり、フィッシャーLSD事後検定（a-b）および両側独立t検定（c-f）を使用した二元配置分散分析で分析されました。 ef での統計分析は、存在量の合計を使用して実行されました。

補足図 1 には、生のウェスタンブロット画像が含まれています。

食事の組成。

LC から MS/MS への移行。

高分解能質量分析の変遷。

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Handzlik、MK、Gengatharan、JM、Frizzi、KE 他インスリンによって調節されるセリンと脂質の代謝は末梢神経障害を引き起こします。 Nature 614、118–124 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41586-022-05637-6

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受信日: 2021 年 12 月 20 日

受理日: 2022 年 12 月 7 日

公開日: 2023 年 1 月 25 日

発行日: 2023 年 2 月 2 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05637-6

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